骨关节炎患者关节软骨TIMP—3启动子区甲基化水平的初步研究

彭红春　谢明　沈奕　彭丹

[摘要] 目的 探讨关节软骨中组织金属蛋白酶抑制因子-3（TIMP-3）基因启动子区甲基化与其蛋白表达的相关性，并分析TIMP-3基因CpG岛异常甲基化与骨关节炎（OA）的关联性。 方法 应用甲基化特异性的聚合酶链反应（MSP）技术和免疫组织化学SP法分别检测14例健康人的正常关节软骨细胞和35例骨关节炎（OA）患者软骨细胞TIMP-3基因启动子区甲基化和蛋白表达情况。 结果 OA患者和健康人关节软骨中TIMP-3基因启动子区均有甲基化修饰，其阳性率分别为74.3%（26/35）和35.7%（5/14），OA组TIMP-3基因启动子区甲基化率明显高于健康组（P<0.05）。14例健康人中，软骨细胞TIMP-3蛋白表达阳性10例（71.4%），而35例OA患者中，软骨细胞TIMP-3蛋白表达阳性11例（31.4%）。24例OA患者软骨细胞蛋白表达阴性的标本中，TIMP-3启动子区甲基化阳性21例（87.5%）；26例TIMP-3启动子区甲基化阳性的标本中，蛋白表达阴性21例（80.8%），TIMP-3启动子区甲基化与蛋白表达呈显著负相关（P<0.05）。 结论 启动子区CpG岛高甲基化是OA患者关节软骨细胞TIMP-3表达失活的主要机制之一，其可能参与了OA的发生和发展。

[关键词] 骨关节炎；甲基化；TIMP-3启动子；CpG岛

[中图分类号] R684.3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）01（b）-0004-04

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是以关节软骨退变和关节周围骨质增生为病理特征的慢性进行性骨关节疾病，其发病机制尚不清楚[1]。有研究认为OA软骨的破坏可能与关节软骨细胞分泌细胞外基质（ECM）降解酶（如胶原酶和蛋白聚糖酶），从而导致ECM降解增加和（或）ECM合成减少有关；而金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）是这些酶的天然抑制剂[2]。TIMP-3为TIMPs家族中的一个特殊成员，在OA患者和正常人软骨细胞中均有表达。TIMP-3能抑制胶原酶和蛋白聚糖酶对ECM的降解，并促进ECM合成[3]。TIMP-3还能下调IL-1、TNF-α、IL-6表达，减少其对骨关节软骨的破坏[4]。研究发现TIMP-3基因敲除小鼠患骨关节炎的易感性增加，而启动子区甲基化可能是 TIMP-3基因失活的机制[5]。笔者采用亚硫酸氢钠测序法（bisulfite sequencing PCR，BSP）检测关节软骨细胞中 TIMP-3基因启动子区甲基化情况，采用免疫组织化学SP方法检测关节软骨细胞中TIMP-3蛋白的表达情况，以探讨TIMP-3基因在OA发生发展中的作用以及其失活机制。

1 材料与方法

1.1 材料

14例正常膝关节软骨组织取自2011年9月～2012年10月年因交通事故在中南大学湘雅二医院行大腿中下段截肢的患者，男性8例，女性6例，年龄19～60岁，平均40岁。30例OA膝关节软骨组织取自2011年9月～2012年10月年在中南大学湘雅二医院就诊，根据1995年美国风湿协会骨关节炎的诊断标准诊断为OA且有膝关节置换手术指征的患者，男16例，女19 例，平均年龄65岁。术中无菌采集标本，每组标本分为2份：1份石蜡包埋，进行免疫组化检测；另1份放液氮罐内保存，以行分子生物学分析。

1.2 亚硫酸氢钠测序

取约50 mg组织，经EDTA脱钙液脱钙后，加入组织裂解液进行匀浆，匀浆经蛋白酶K消化，用心吸附柱法提取软骨组织DNA，外分光光度计检测DNA纯度和浓度，4℃保存备用，用琼脂糖电泳法鉴定DNA完整性。取30 μl DNA水溶液用EZ DNA Methylation-Gold KitTM DNA甲基化试剂盒（北京天漠公司）进行纯化和修饰。处理好的DNA放入-70℃冰箱保存。

采用Methyl Primer Express V1.0软件（ABI公司）设计TIMP-3基因启动子区甲基化引物序列，并由上海英骏生物工程技术服务有限公司合成。TIMP-3甲基化上游引物序列为5′-CGTTTCGTTATTTTTT-GTTTTCGGTTTC-3′，下游引物序列为5′-CCGAAA-ACCCCGCCTCG-3′（116 bp），TIMP-3非甲基化上游引物序列为5′-TTTTGTTTTGTTATTTTTTGTTTTTGGTTTT-3′，下游引物序列为5′-CCCCCAAAAACCCCACCTCA-3′（122 bp）。PCR总反应体系20 μl：模板DNA为2 μl，Taq 酶10 μl，上游及下游引物各0.8 μl，加ddH2O至总体积20 μl。取10 μl PCR 扩增产物上样，1.5%琼脂糖凝胶电泳60 min（电压100 V），溴乙锭染色，紫外灯下检测扩增产物，数码相机摄片保存，PCR产物 4℃保存备用。

1.3免疫组织化学检测

石蜡包埋组织标本，5 μm连续切片。采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶SP法检测， 切片常规脱蜡处理后，置于抗原修复液中95℃ 10～15 min进行修复，其余步骤参照说明书进行。切片经梯度乙醇脱水、干燥，二甲苯透明，中性树胶封固后，在显微镜下观察并拍照。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件，计数资料数据采用百分率表示，各组间率的比较采用χ2检验、Fisher 确切概率法检验和Spearman等级相关分析。

2 结果

2.1 DNA完整性检测

提取的基因组DNA经2%琼脂糖凝胶电泳，DNA片段明显大于1000 bp，DNA完整，无降解（图1）。

图1 琼脂糖凝胶电泳中的DNA片段

2.2 两组关节软骨细胞TIMP-3启动子区甲基化状态比较

以不加DNA标本为空白对照组，其中OA患者与健康人软骨中TIMP-3启动子区甲基化阳性率分别为74.3%（26/35）和35.7%（5/14），两组差异有统计学意义（χ2=6.402，P=0.0114）（图2，表1）。

图2 琼脂糖凝胶电泳法显示的健康组及OA组关节软骨中

TIMP-3启动子区甲基化情况

M.TIMP-3甲基化引物扩增后的产物（116 bp）；U.TIMP-3非甲基化引物扩增后的产物（122 bp）；A.OA组关节软骨细胞； B.健康组关节软骨细胞；C.空白对照

表1 OA组和健康组关节软骨中TIMP-3启动子区甲基化水平

2.3 两组关节软骨细胞TIMP-3蛋白表达情况

TIMP-3蛋白表达阳性表现为胞质或核膜出现棕黄色染色，经分析健康人和OA患者膝关节软骨细胞TIMP-3蛋白阳性率分别是71.4%（10/14）和31.4%（11/35），两组差异有统计学意义（χ2=6.533，P=0.0106）（图3，表2）。

A B C

图3 TIMP-3蛋白在骨关节炎患者软骨中的表达（SP×200）

A.阴性（胞质或核膜出现蓝色染色）；B.阳性（胞质或核膜出现棕黄色染色）；C.健康组阳性（胞质或核膜出现棕黄色染色）

表2 健康组和OA组关节软骨细胞中TIMP-3蛋白表达情况

2.4 OA患者软骨细胞TIMP-3启动子区甲基化状态与蛋白表达的关系

26例TIMP-3启动子区甲基化阳性的OA患者中，21例TIMP-3蛋白表达阴性（80.8%）；而24例TIMP-3蛋白表达阴性的OA患者中，21例TIMP-3启动子甲基化阳性（87.5%）。Spearman等级相关分析表明TIMP-3启动子甲基化与蛋白表达呈显著负相关（rs=-0.447，P=0.000）（表3）。

表3 OA患者软骨细胞TIMP-3启动子甲基化状态与蛋白表达的关系

3 讨论

骨关节炎的病理表现为关节软骨进行性破坏和关节周围骨赘形成，考虑可能与关节软骨细胞外基质的分解与合成代谢失衡有关[6]。已有研究证明基质金属蛋白酶（MMPs）对关节软骨细胞外基质的损伤是OA发病机制之一。TIMPs是MMPs的特异性抑制剂，TIMPs与MMPs之间的平衡对机体内细胞的迁移和ECM重建起关键作用，平衡一旦遭到破坏，将导致一系列病理过程的发生[7]。TIMP-3是TIMPs家族中唯一存在于ECM中的非溶性蛋白质，与ECM紧密结合，避免ECM受金属蛋白酶及蛋白聚糖酶的降解。

在骨关节炎中，IL-1、IL-6、TNF-α等炎症介质使骨关节软骨中MMPs水平升高，从而使骨关节软骨外周基质破坏增加[4，8]。而当TIMP-3水平升高时，能负反馈调节其对软骨外周基质的破坏作用。由于OA是随年龄增长的退行性病变，从胚胎发育到成年，骨与关节组织中TIMP-3启动子活性逐渐降低[9]。此外，Mahmoodi等[5]研究发现在TIMP-3基因敲除小鼠中，TIMP-3表达缺失可增加小鼠骨关节炎的易感性。同样Zreiqat 等[10]研究表明，在OA中晚期，骨关节软骨组织中TIMP-3水平明显下降。本研究也发现与正常患者相比，OA患者骨关节软骨组织中TIMP-3蛋白表达较低。这与Zreiqat 等[10]的研究结果一致。因此，笔者推测TIMP-3蛋白表达下降或活性丧失可能是OA的发病机制之一。然而，在OA发病过程中，TIMP-3表达下降的原因尚不清楚。

DNA甲基化通常发生在CpG位点的C上，其能使某些基因的活性丧失[11]。多研究表明在肿瘤组织中存在TIMP-3启动子区甲基化，其可导致TIMP-3基因表达下降和缺失。TIMP-3基因启动子区甲基化水平随年龄增加而升高[9，12]。因此，笔者推测OA患者骨与关节组织TIMP-3表达下降，可能与基因启动子区甲基化水平升高有关。本研究发现OA患者和健康人软骨细胞TIMP-3启动子区甲基化阳性率分别为74.3%（26/35）和35.7%（5/14），提示OA患者TIMP-3呈高甲基化状态。除此之外，TIMP-3蛋白表达阴性的OA患者其TIMP-3启动子区甲基化阳性，而某些TIMP-3启动子区甲基化阳性的标本无蛋白表达，进一步统计分析表明基因启动子区甲基化与蛋白表达呈显著负相关。因此，笔者认为TIMP-3甲基化可能与OA发展过程中TIMP-3蛋白表达降低有关。

TIMP-3启动子区异常甲基化时，转录激活复合物呈分散状态，无法作用于DNA，从而转录失活和TIMP-3蛋白表达受限；当TIMP-3对金属蛋白酶及蛋白聚糖酶的抑制作用减弱或消失后，炎性因子IL-1、TNFα及IL-6对软骨的破坏作用也减弱或消失，从而软骨外周基质降解增加，最终导致OA的发生和发展。

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（收稿日期：2013-08-02 本文编辑：魏玉坡）

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（收稿日期：2013-08-02 本文编辑：魏玉坡）