他汀类药物稳定载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块的作用

周晓斌，杨丽霞，郭明，刘莉，郭瑞威，梁星

基础与实验研究

他汀类药物稳定载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块的作用

周晓斌，杨丽霞，郭明，刘莉，郭瑞威，梁星

目的：明确他汀类药物在载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠中稳定动脉粥样硬化斑块的作用。

方法：将24只8周龄ApoE-/-小鼠随机分为对照组（n=12）和他汀组（n=12），高脂饲养建立动脉粥样硬化模型。他汀组用阿托伐他汀[10 mg/（kg.d）]灌胃，8周后处死所有小鼠取主动脉弓制成石蜡切片，行苏木素伊红染色、免疫组化、天狼星红染色，评估斑块的相对面积、斑块稳定性（用纤维帽厚度/内膜中层厚度表示）、斑块易损指数[VI＝（脂质空泡+巨噬细胞）/（平滑肌细胞+胶原纤维）]。

结果：与对照组相比，他汀组小鼠的斑块相对面积减小[（0.36±0.09）vs （0.46±0.09），P＜0.01]，纤维帽厚度/内膜中层厚度增加[（71.52±16.48）vs （51.93±21.94），P＜0.05]，易损指数降低[（2.73±2.02）vs （8.94±0.67），P＜0.05）。他汀组斑块内含有较少的脂质空泡[（0.51±0.11）vs（0.62±0.10），P＜0.05]和巨噬细胞[（0.06±0.04）vs（0.09±0.04），P＜0.05]，较多的平滑肌纤维[（0.18±0.05） vs （0.10±0.06），P＜0.01]和胶原纤维[（0.08±0.06） vs（0.03±0.04），P＜0.05]。

结论：他汀类药物增加ApoE-/-小鼠主动脉粥样硬化斑块的稳定性。

他汀；冠状动脉粥样硬化；不稳定斑块

Methods: A total of 24 ApoE-/-mice at 8 weeks of age were used, the atherosclerosis model was established by high fat diet for 8 weeks and the mice were randomized into 2 groups. Statin group, the mice were lavaged with atorvastatin 10 mg/(kg.d) and Control group, the mice received normal saline. n=12 in each group. The HE staining, Sirius red staining and immuneohistochemistry staining were respectively conducted to evaluate the relative plaque area, the fi brous cap thickness/tunica intima media thickness (FCT/IMT) and the plaque vulnerability index (VI), VI = lipoid vesicles+ macrophages/smooth muscle cells + collagen.

Results: Compared with Control group, Statin group showed smaller plague area (0.46±0.09) vs (0.36±0.09), P<0.01, higher ratio of FCT/IMT (51.93±21.94) vs (71.52±16.48), P<0.05, and decreased VI (8.94±0.67) vs (2.73±2.02), P<0.05. Compared with Control group, the plaque in Statin group had less lipoid vesicles (0.62±0.10) vs (0.51±0.11), less macrophages (0.09±0.04) vs (0.06±0.04), all P<0.05 and more smooth muscle cells (0.10±0.06) vs (0.18±0.05), P<0.01, more collagen (0.03±0.04) vs (0.08±0.06), P<0.05.

Conclusion: Statin increased the stability of the atherosclerosis plaque in ApoE-/-mice.

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:296.)

急性冠状动脉（冠脉）综合征主要归咎于易损斑块的破裂，对易损斑块研究是目前心血管领域的热点和难点。病理学研究证明，易损斑块的特点是斑块中胶原和平滑肌细胞减少，纤维帽变薄，脂质池周围有大量的活化巨噬细胞浸润。循证医学证据提示，目前唯一公认的稳定斑块的药物为他汀类药物，但对其稳定斑块的机制尚无统一定论，本研究评估了阿托伐他汀干预载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠的动脉粥样硬化斑块的作用，试图探讨他汀类药物稳定斑块的机制。

1 材料与方法

实验材料：2011-01至2012-05，实验动物为8周龄ApoE-/-雄性小鼠24只，平均体重（23.39±1.12）g，购于北京大学医学部动物实验中心，动物质量合格证号：SCXK（京）2009-007。

主要试剂：阿托伐他汀原药（美国辉瑞公司赞助），苏木素伊红（成都科龙化工公司），SV-0002免疫组化试剂盒（武汉博士德公司），DAB 显色液（ZLI-9032，北京中杉金桥），巨噬细胞抗体 MAC387（Abcom公司，美国），平滑肌细胞抗体 α-actin（Santa Cruz公司，美国），天狼星红-饱和苦味酸液（成都科龙化工公司），天青石蓝液（成都科龙化工公司）。主要仪器设备：石蜡切片机（A130328，中国），荧光倒置显微镜（Leica DMIRB，德国），Leica DFC图像采集软件（Leica microsystems，德国），图像分析软件IPP 6.0（Media Cybernetics，美国）。

动物饲养：用普通饲料适应性喂养8周龄的ApoE-/-小鼠，1周后开始高脂饲养，高脂饲料配方为普通饲料+1.25%胆固醇+15%猪油。小鼠饲养条件：清洁（SPF级）动物房，温度18～22℃，湿度50%～60%，12 h/12 h光照/黑暗交替实验环境饲养。保持室内空气新鲜，氨浓度不超过20 ppm，换气次数应10～20次/h。垫料选用阔叶林木的锯末，经消毒灭菌处理后使用，每日更换垫料。饮水标准不低于城市生活饮水的卫生标准，用饮水瓶给水，每日换水。

试验分组与干预：用随机数字法将24只ApoE-/-小鼠分为对照组和他汀组，每组各12只。从第9周龄开始干预，他汀组用阿托伐他汀[10 mg/（kg.d）]灌胃，对照组用等量生理盐水灌胃，每日灌胃量定为3 ml，每晚1次。每周称体重以调整小鼠的给药浓度。第17周龄末处死所有小鼠。

制作标本：取小鼠主动脉弓，用新鲜配制好的4%多聚甲酫固定。制成石蜡切片，每张切片厚度为10 μm。每隔相邻的10张切片取1张做苏木素伊红染色。主要步骤为：脱蜡至水，苏木素染色 5 min，1%盐酸乙醇分化1～3 s，0.5%伊红液染色 1～3 min，脱水透明，中性树胶封片。根据苏木素伊红染色结果，每只小鼠选取斑块面积最大的1张切片测量斑块相对面积，纤维帽厚度/内膜中层厚度和脂质空泡相对面积，其后连续的3张切片分别做巨噬细胞免疫组化，平滑肌细胞免疫组化，胶原纤维天狼星红染色。

免疫组化主要步骤：脱蜡至水后，3%H2O2覆盖组织5 min去除过氧化物酶。微波抗原修复，温度严格控制在92～96℃。室温下封闭20 min。每个组织区域加入1:200稀释的抗体30 μl，阴性对照加入等量的蒸馏水，4℃过夜。加入聚合HRP标记抗兔IgG（SV-0002），37℃孵育30 min。二氨基联苯胺（DAB）显色后苏木素复染10 min。脱水透明，中性树胶封片。

天狼星红染色：石蜡切片脱蜡至水，加入天青石蓝液10 min，蒸馏水冲洗3次，天狼星红饱和苦味酸液1 h，苏木素液淡染细胞核，无水乙醇分化与脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

IPP图像分析：斑块相对面积＝斑块面积/血管腔面积，斑块稳定性＝纤维帽厚度/内膜中层厚度，纤维帽厚度＜65 μm定义为不稳定斑块，脂质空泡相对含量＝脂质空泡面积/斑块面积，组织相对表达＝斑块内目标细胞累积光密度值/斑块面积，易损指数（VI）＝（巨噬细胞+脂质空泡）/（平滑肌细胞+胶原纤维）。

统计学方法：应用SPSS 17.0统计软件分析数据。数据用均数±标准差表示。两组间均值比较采用成组t检验，方差不齐选择t′检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1两组ApoE-/-小鼠的主动脉斑块面积比较

显微镜下观察，他汀组与对照组皆有斑块生长。对照组的动脉内膜明显增厚，斑块面积较大，斑块周围可见明显的上皮细胞增生；他汀组的动脉内膜稍增厚，斑块面积较小（图1）。统计结果显示他汀组斑块面积小于对照组[（0.36±0.09）vs （0.46±0.09），t=2.850，P＜0.01）]，差异有统计学意义。表1

表1 两组小鼠主动脉斑块数据汇总

2.2两组小鼠主动脉斑块的稳定性比较

用纤维帽厚度/内膜中层厚度代表斑块的稳定性，他汀组小鼠的斑块稳定性大于对照组 [（0.56±0.09）vs（0.26±0.13），t=-6.913，P＜0.01]，差异有统计学意义（表1）。根据纤维帽厚度＜65 μm定义为不稳定斑块[1]，他汀组主要为稳定斑块（51.93±21.94） μm，对照组主要为不稳定斑块（71.52±16.48） μm，t=-2.318，P＜0.05，两组差异有统计学意义。表1

2.3两组小鼠主动脉斑块内脂质空泡含量的比较

分析苏木素伊红染色结果（图2），脂质空泡的含量间接代表脂质的相对含量，他汀组小鼠主动脉斑块内脂质空泡明显少于对照组[（0.51±0.11） vs（0.62±0.09），t=2.597，P＜0.05]，差异有统计学意义。表1

2.4两组小鼠主动脉斑块内巨噬细胞数量的比较

免疫组化结果显示：斑块内巨噬细胞被染色黄褐色（图3箭头所指）。对照组小鼠主动脉斑块斑块内大量巨噬细胞浸润，多分布于斑块的肩部，而他汀组小鼠主动脉斑块斑块内巨噬细胞较少。统计结果显示：他汀组巨噬细胞的含量少于对照组[（0.06±0.04）vs （0.09±0.04），t=2.083，P＜0.05]，差异有统计学意义。表1

2.5两组小鼠主动脉斑块内平滑肌细胞数量的比较

斑块内平滑肌细胞后被染成褐色（图4箭头所指），显微镜下观察，对照组小鼠主动脉斑块纤维帽内平滑肌层菲薄，而他汀组纤维帽内含有较厚的平滑肌层。统计结果显示，他汀组斑块内平滑肌细胞含量明显多于对照组[（0.18±0.05）vs （0.10±0.06）]，差异有统计学意义（t=-3.445，P＜0.01）。表1

2.6两组小鼠主动脉斑块内胶原纤维含量的比较

用天狼星红染色显示胶原成份，斑块内Ⅰ型胶原纤维被染成红色和黄色，Ⅲ型胶原纤维被染成绿色（图5箭头所示），他汀组含有丰富的胶原成分。统计结果显示：他汀组的胶原含量明显多于对照组[（0.08±0.06）vs（0.03±0.04）]，差异有统计学意义（t'=-2.388，P＜0.05）。表1

图1 两组ApoE-/-小鼠主动脉内斑块相对面积比较（×100）

图2 两组ApoE-/-小鼠主动脉斑块内脂质空泡含量比较（×100）

图3 两组ApoE-/-小鼠主动脉斑块内巨噬细胞含量比较（×100）

图4 两组ApoE-/-小鼠主动脉斑块内平滑肌细胞含量比较（×100）

图5 ApoE-/-小鼠主动脉斑块内胶原含量比较（×100）

2.7两组小鼠的易损指数比较

与对照组相比，他汀组小鼠主动脉粥样硬化斑块内促进斑块不稳定的成份（如脂质和巨噬细胞）含量减少，增加斑块稳定性的成份（如平滑肌细胞和胶原纤维）增多。统计结果显示，他汀组斑块易损指数明显低于对照组[（2.73±2.02）vs（8.94±0.67），t'=2.417，P＜0.05]，差异有统计学意义。表1

3 讨论

本研究采用斑块相对面积，纤维帽厚度/内膜中层厚度，易损指数等指标来评估易损斑块，从脂质、巨噬细胞、平滑肌细胞和胶原纤维等角度探讨他汀稳定斑块的作用机制。

他汀可减少动脉粥样硬化斑块大小及增加斑块的稳定性。Insull等[2]证明他汀可减少冠心病患者动脉粥样硬化斑块的大小；临床研究证明他汀可明显减少斑块的黄色病变期（不稳定斑块），从而发挥稳定冠状动脉粥样硬化斑块的作用[3]，Takarada等[4]证实他汀可增加心肌梗塞患者斑块纤维帽厚度。以上试验证明了他汀对人动脉粥样硬化的治疗作用，但无法对斑块大小及稳定性做精确直接的测量。我们对斑块稳定性的评估不仅从斑块大小的水平上采用了纤维帽厚度和纤维帽厚度/内膜中层厚度的指标，而且从斑块组成成分的角度上引入了易损指数的指标[5]，从两个层面证实了他汀对斑块易损性的影响。通过8周的干预，他汀使ApoE-/-小鼠主动脉斑块的相对面积减少了21.7%，同时使斑块的稳定性增加了37.7%。

动脉粥样硬化斑块影响稳定性的重要成分为脂质，主要包括两部分：脂质池和摄取了脂质的巨噬细胞（即泡沫细胞）。Tsuchiya等[6]研究证明了动脉粥样硬化斑块内脂质沉积和巨噬细胞浸润与他汀的干预有直接关系。本研究证明他汀明显减少ApoE-/-小鼠主动脉粥样硬化斑块内脂质和巨噬细胞的含量，从而增加了斑块的稳定性。此作用可能得益于他汀的调脂机制，即降低血清低密度脂蛋白胆固醇的浓度，减少脂质在斑块内的沉积；也可能通过抑制巨噬细胞的促炎症、斑块破裂以及血栓的作用，达到抗动脉粥样硬化的作用。

平滑肌细胞和胶原纤维共同构成了斑块内的“钢性骨架”，维持斑块的稳定性。我们的实验结果显示：他汀增加了动脉粥样硬化斑块内平滑肌细胞和胶原纤维的含量。其抗动脉粥样硬化的相关机制可能与下列因素有关：疾病初期，他汀抑制血管平滑肌细胞增殖与迁移，促进血管平滑肌细胞凋亡，抑制斑块的形成；疾病发展期，他汀抑制巨噬细胞及平滑肌细胞分泌基质金属蛋白酶，同时诱导巨噬细胞及血管平滑肌细胞表达和分泌组织型金属蛋白酶抑制物因子-1，以抑制胶原降解，从而使斑块趋于稳定。

综上所述，大剂量他汀可减少动脉粥样硬化斑块的正性重构，稳定动脉粥样硬化斑块；他汀可能通过多种机制减少斑块内脂质和沉积和巨噬细胞的浸润，增加了平滑肌细胞和胶原的含量，从而降低了斑块的易损性。本研究进一步为他汀稳定动脉粥样硬化斑块的机制提供了多角度的思考，但对这一机理的全面而深入的阐释尚需要更多证据的支持。

[1] Burke AP, Farb A, Malcom GT, et al. Coronary risk factors and plaque morphology in men with coronary disease who died suddenly. N Engl J Med, 1997, 336: 1276-1282.

[2] Insull W Jr. The pathology of atherosclerosis: plaque development and plaque responses to medical treatment. Am J Med, 2009, 122(1 Suppl): S3-S14.

[3] Hirayama A, Saito S, Ueda Y, et al. Plaque-stabilizing effect of atorvastatin is stronger for plaques evaluated as more unstable by angioscopy and intravenous ultrasound. Circ J, 2011, 75: 1448-1454.

[4] Takarada S, Imanishi T, Kubo T, et al. Effect of statin therapy on coronary fibrous-cap thickness in patients with acute coronary syndrome: assessment by optical coherence tomography study. Atherosclerosis, 2009, 202: 491-497.

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[6] Tsuchiya A, Nagotani S, Hayashi T, et al. Macrophage infiltration, lectin-like oxidized-LDL receptor-1, and monocyte chemoattractant protein-1 are reduced by chronic HMG-CoA reductase inhibition. Curr Neurovasc Res, 2007, 4: 268-273.

Statin Stabilized the Atherosclerosis Plaque in Apo-lipoprotein E Gene Knockout Mice

ZHOU Xiao-bin, YANG Li-xia, GUO Ming, LIU Li, GUO Rui-wei, LIANG Xing.
Department of Cardiology, Kunming General Hospital of Chengdu Military Command, Kunming (650032), Yunnan, China Corresponding Author: YANG Li-xia, E-mail:doctorylixia@aliyun.com

Objective: To clarify the plaque stabilization effect of statin in the apo-lipoprotein E gene knockout (ApoE-/-) mice.

Statin; Atherosclerosis; Vulnerable plague

2013-09-26）

（助理编辑：许菁）

650032 云南省昆明市，成都军区昆明总医院 心血管内科（周晓斌、杨丽霞、郭瑞威、梁星）；武警云南省总队医院（郭明、刘莉）

周晓斌 硕士研究生 主要从事心血管病基础研究 Email: doctorzhouxiaobin@163.com. 通讯作者：杨丽霞 Email: doctorylixia@aliyun.com

R54

A

1000-3614（2014）04-0296-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.04.015