甘肃武威西门塔尔牛MSTN基因外显子遗传变异的研究

孙雪婧，高雪晋，李积友，杜晓华，刘 霞，杨孝朴

（1．甘肃农业大学动物医学院，甘肃省草食动物生物技术重点实验室，兰州 730070；2.甘肃农业大学生命科学技术学院；3.甘肃省畜牧业产业管理局；4.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃省草食动物生物技术重点实验室；5.甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070）

遗传育种

甘肃武威西门塔尔牛MSTN基因外显子遗传变异的研究

孙雪婧1，高雪晋2，李积友3，杜晓华1，刘 霞4，杨孝朴5

（1．甘肃农业大学动物医学院，甘肃省草食动物生物技术重点实验室，兰州 730070；2.甘肃农业大学生命科学技术学院；3.甘肃省畜牧业产业管理局；4.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃省草食动物生物技术重点实验室；5.甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070）

为分析肉牛MSTN基因的遗传多态性及变异特征，采用PCR-SSCP方法检测了60头甘肃武威西门塔尔牛MSTN基因的多态性，对群体内各等位基因进行了克隆测序。结果显示：武威西门塔尔牛MSTN基因第1外显子存在A、B两个等位基因以及AA、AB两种基因型，基因型频率分别为0.916 7、0.083 3；第2外显子存在A、B两个等位基因以及AA、BB、AB三种基因型，基因型频率分别为0.5、0.25、0.25。序列分析表明，武威西门塔尔牛MSTN第1外显子在269 bp发生了A→G的突变，第2外显子在41 bp发生了C→T的突变，二者均属于同义突变。统计结果表明，武威西门塔尔牛MSTN基因第1外显子呈低度多态，第2外显子呈中度多态，外显子3没有发生突变。

MSTN基因；遗传多态性；西门塔尔牛

肌肉生成抑制素（myostatin,MSTN）又称生长分化因 子8（growth differentiation factor 8,GDF-8），是转化生长因子超家族中的一员，对肌肉的分化和生长有负调控功能［1］。研究发现该基因的缺失、插入或突变会引起肌细胞增生与肌纤维肥大，从而提高产肉力，表现出“双肌”性状［2］，在肉用家畜的品种选育上有重要作用。

近几年来对MSTN基因的研究一直十分活跃，对牛、绵羊、山羊、猪、马等家畜MSTN基因的多态性也都有相关的研究报道［3-5］。但有关西门塔尔牛MSTN基因的研究鲜见报道。甘肃省武威市为改良本地河西黄牛产肉产奶性能，从1980年开始引用乳肉兼用型西门塔尔牛冻精与本地牛杂交［6］，为观察其后代的遗传稳定性，本研究采用PCR-SSCP方法对60头甘肃武威西门塔尔牛MSTN基因进行多态性分析，探讨武威西门塔尔牛群体MSTN基因的分子遗传特性，为武威西门塔尔牛MSTN基因的分子生物学研究及其分子育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 血样采集

随机选取甘肃省武威市60头西门塔尔牛，每头牛颈静脉采血10 mL，ACD（酸性柠檬酸葡萄糖）抗凝，-70℃冻存备用。

1.2 主要试剂与仪器

蛋白酶K、Tris平衡酚购自大连宝生物工程有限公司；丙烯酰胺、硼酸、乙二胺四乙酸（EDTA）购自Amersco公司；过硫酸铵购自烟台市双双化工有限公司；去离子甲酰胺、TEMED购自Sigma公司；甲叉购自上海生工生物工程股份有限公司；2×Power Taq PCR MasterMix购自北京百泰克生物技术公司；DNAmarker购自上海捷瑞生物工程有限公司；其他常规试剂均为进口或国产分析纯级产品。梯度PCR仪为美国ABI公司生产；PROTEANⅡxi Cell双垂直电泳槽、Powerpac Universal电泳仪：美国BIO-RAD公司生产；F32加热／制冷循环仪：德国Julabo公司生产。

1.3 基因组DNA的提取

用酚-氯仿法从血样中提取甘肃武威西门塔尔牛基因组DNA，-20℃冻存。

1.4 引物设计与PCR扩增

参考GenBank中的牛（AC_000159）MSTN基因序列，用在线设计引物软件Primer3.0设计3对引物，由北京六合华大基因有限公司合成，各引物序列见表1。

表1 武威西门塔尔牛MSTN基因3个外显子的引物序列及预扩增片段长度

PCR反应体系为20 μL：7.4 μL ddH2O，引物F和R各0.4 μL，2×Power Taq PCR MasterMix 11 μL，0.8 μL模板。反应条件：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，外显子1、2、3的退火温度分别为57℃、56℃、58℃，退火时间为30 s，共35个循环，最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 SSCP检测

取2 μL的PCR产物加入8 μL的变性上样缓冲液（980 mL/L去离子甲酰胺，0.25 g/L溴酚蓝，0.25 g/L二甲苯青，pH值8.0，0.01 mol/LEDTA），105℃变性10 min，立即冰浴10 min。3个片段均用100 g/L的非变性聚丙烯酰胺凝胶（Acr:Bis的质量比39:1），胶浓度均为14%，电压分别为150、180和180 V，电泳时间为24、22和22 h，温度条件分别为4℃、10℃和10℃，银染法显色后拍照。将PCR产物送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。

1.6 数据统计分析

利用DNAStar软件包中的EditSeq和MegAlign程序进行DNA序列的剪切校对、比对和翻译，碱基组成一致的序列判定为同种等位基因。基因型频率、基因频率统计和X2检验、基因杂合度（heterozygosity,He）及有效等位基因数（effective number of alleles,Ne）检测利用POPGENE（版本1.32）软件完成，多态信息含量（polymorphism information content,PIC）利用PIC_Calc（版本0.6）软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增

甘肃武威西门塔尔牛MSTN基因3个外显子扩增结果经琼脂糖凝胶电泳检测，与预期扩增片段的长度相符，且条带清晰明亮无杂带，可直接用于SSCP分析（图1）。

图1 武威西门塔尔牛MSTN基因3个外显子的PCR扩增

2.2 SSCP检测

SSCP分析结果显示，所检测的60头武威西门塔尔牛中发现第1外显子受A、B两个等位基因控制，存在AA、AB两种基因型；第2外显子受A、B两个等位基因

控制，存在AA、BB、AB三种基因型；第3外显子只有AA 一种基因型，无多态（图2、图3）。

图2 武威西门塔尔牛MSTN基因外显子1 SSCP检测

图3 武威西门塔尔牛MSTN基因外显子2 SSCP检测

2.3 序列分析

对具有多态性的PCR产物进行测序，得到甘肃武威西门塔尔牛MSTN基因第1外显子396 bp的核苷酸序列、第2外显子382bp的核苷酸序列和第3外显子404bp的核苷酸序列。外显子1中的AB型与AA型相比，AB型的核苷酸序列在第269 bp处发生A→G突变（图4），密码子由GAA变为GAG，突变前后所编码的氨基酸均为谷氨酸，为同义突变。外显子2中的AB（BB）型与AA型相比，AB（BB）型的核苷酸序列在第41 bp处发生C→T突变（图5），密码子由UGC变为UGU，突变前后所编码的氨基酸均为半胱氨酸，也为同义突变；第3外显子核苷酸序列没有突变。

图4 外显子1 AA，AB基因型位于269 bp处突变的测序峰图

图5 外显子2 AA,AB和BB基因型位于41 bp处突变的测序峰图

2.4 遗传多态性分析

对60头武威西门塔尔牛MSTN基因3个外显子的等位基因的基因型频率、基因频率进行了统计，并计算了其纯合度、杂合度和多态信息含量值，结果见表2。

由上表2可以看出，武威西门塔尔牛MSTN基因第1外显子和第2外显子中A等位基因是群体中的优势等位基因，并且由表中He、Ne及PIC值也可得出第1外显子表现为低度多态，第2外显子表现为中度多态。第3外显子没有突变位点。

X2检测结果显示，第1外显子2个基因型、第2外显子3个基因型均在武威西门塔尔牛群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态（P＞0.05）。

表2 武威西门塔尔牛MSTN基因3个外显子的等位基因频率、基因型频率及一些相关的多态性指标

3 讨论与结论

MSTN基因作为肌肉生长的负调控因子，它的缺失会使一些动物表现出“双肌”性状，双肌牛具有较多的白色肌纤维和分枝轴突末梢，肌肉中的胶原蛋白含量少，故双肌牛肉肉质较嫩。此外，双肌牛肉中白纤维比例高而肌红蛋白含量降低而造成肌肉颜色较浅，故对MSTN基因突变的研究是提高牛肉品质性状的主要途径。目前，关于牛MSTN基因的研究多，该基因虽然在进化过程中很保守，但也存在一定的多态性［4］。Kambadur等［7］和Miranda等［8］在研究比利时蓝牛“双肌”性状时发现，MSTN基因第3外显子存在一个11 bp的缺失，使得在缺失位点下游形成一个终止密码子，导致MSTN基因C-末端仅7个氨基酸得到翻译，翻译出一个截断的蛋白，从而失去了原来抑制肌肉生长的特性，使肌肉过度发育增大。造成比利时蓝牛产生“双肌”性状。Lee等［9］在皮埃蒙特牛MSTN基因中发现某些单核苷酸替换也导致了MSTN蛋白质功能的丧失。Grobet等［10］检测了分布于欧洲的10种牛种中32个双肌牛个体的MSTN基因编码序列，发现7个多态性位点，其中5个导致该基因功能蛋白突变，在内含子区有4个DNA序列的多态性。

本研究利用PCR-SSCP方法分析了武威西门塔尔牛MSTN基因3个外显子的多态性，结果表明，武威西门塔尔牛MSTN基因第1外显子在269 bp发生了A→G的突变，存在AA、AB两种基因型；第2外显子在41 bp发生了C→T的突变，存在AA、BB、AB三种基因型，而且这两处突变均未导致氨基酸的改变。在对60头武威西门塔尔牛群体基因型的检测中，外显子1只发现5例AB型突变杂合体，未检测到BB型，其基因型频率远低于AA型，表明等位基因B在进化及群体遗传过程中受到一定的选择压力，其纯合个体可能由于某种原因被自然选择或人工选择所淘汰，导致BB型在群体遗传过程中被稀释或消失，推测该过程可能是一种完全淘汰隐性基因的选择效应，而A等位基因在人工选育过程中则受到正向选择，处于优势地位。Wheeler等［12］发现不同MSTN突变的基因型对皮埃蒙特牛的各部位肌肉嫩度等指标存在显著影响。武威西门塔尔牛第1外显子和第2外显子的突变是否会对整个MSTN蛋白表达及其在群体中的遗传效应产生影响，还有待更进一步的研究证实。

多态信息含量（PIC）和杂合度（He）都是群体内遗传变异的测度，其值的高低反映了群体内个体的均质度，遗传变异大，数值就高。Botstein D等提出了确定位点多态性的标准：PIC＞0.5为高度多态，PIC＜0.25为低度多态，0.25＜PIC＜0.5则为中度多态。本研究中，武威西门塔尔牛MSTN基因第1外显子基因座的多态信息含量是0.076 7，表现为低度多态；第2外显子基因座的多态信息含量是0.358 9，表现为中度多态；第3外显子为单态位点。说明武威西门塔尔牛遗传多样性偏低，这可能是育种选择所致。此外，本研究证实武威西门塔尔牛群体处于Hardy-Weinberg平衡状态，这说明对武威西门塔尔牛的选择压力可能仍然不够强。因此，在武威西门塔尔牛群体的改良过程中，可以加大人工选育力度，以便选育出肉品质更高的优良品种。

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Polymorphism in Exons of MSTN Gene in Wuwei Simmental

Sun Xue-jing1，GaoXue-jin2，YangXiao-pu1，et al
（1.Animal Medical College ofGansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.College ofLife Science and Technology，Gansu Agricultural University）

In order to study the polymorphism and variation in exons of MSTN gene in 60 Wuwei Simmental.DNA fragment containing the exons of MSTN gene was amplified and genotyped using PCR single-strand conformational polymorphism（SSCP）method.Representative alleles were sequenced bycloningfor verification oftheir variations in DNA sequences.The results showed that the polymorphism in the exon 1 was controlled by A and B alleles which formed two genotypes namely AA and AB with frequencies at 0.916 7 and 0.083 3 respectively;that the polymorphism in the exon 2 was controlled by A and B alleles which formed three genotypes namely AA，BB and AB with frequencies at 0.5，0.25 and 0.25 respectively;that the polymorphism in the exon 3 was onlycontrolled byAallele which formed one genotypes namelyAA.Sequence analysis indicated that there was a single nucleotide mutation including A to G at 269th nucleotide in the exon land a single nucleotide mutation including C to T at 41th nucleotide in the exon 2，but noaminoacid change；that there was nonucleotide mutation in the exon 3.The overall results showed that exon 1 ofMSTN gene had a lowlevel ofgenetic diversityin Wuwei Simmental;that exon 2 of MSTN gene had a middle level of genetic diversityin Wuwei Simmental.

MSTN gene；genetic polymorphism；Simmental

S823.2

A

2095-3887（2014）05-0005-05

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.05.001

2014-07-07

孙雪婧（1970-），男，副教授，博士。

杨孝朴（1962-），男，教授，硕士生导师，主要从事生物化学与分子生物学的研究。