谷氨酰胺和IGF-I对晋岚绒山羊卵母细胞体外成熟的影响

张春香，秦 雪，郑亚琳，张彩霞，岳文斌，任有蛇，靳 黎

（山西农业大学动物科技学院，太谷 030801）

谷氨酰胺和IGF-I对晋岚绒山羊卵母细胞体外成熟的影响

张春香，秦 雪，郑亚琳，张彩霞，岳文斌，任有蛇，靳 黎

（山西农业大学动物科技学院，太谷 030801）

为了探讨在成熟培养液中添加谷氨酰胺和IGF-I对晋岚绒山羊母羔卵母细胞体外成熟的影响。随机选择12只6～8周龄晋岚绒山羊母羔为试验动物，用FSH进行超数排卵，活体采集卵母细胞，并对未成熟的卵母细胞进行体外成熟培养。在培养液中添加0、50、100和150 μg/mL的谷氨酰胺及0、25、50和100 ng/mL的IGF-I。结果表明：培养液中谷氨酰胺添加量为100 μg/mL时，能显著提高卵母细胞成熟率（P<0.05）；在培养液中添加100 μg/mL谷氨酰胺的基础上，再添加50 ng/mL的IGF-I可以进一步显著提高卵母细胞的成熟率（P<0.01）。

晋岚绒山羊母羔；卵母细胞；体外成熟；谷氨酰胺；IGF-I

类胰岛素样生长因子（IGF-I）是一种常用的生长因子，通过自分泌或旁分泌的途径，刺激各类细胞的增殖和生长［1］。IGF-I对卵母细胞的成熟是有双向作用的，在一定浓度范围内对卵母细胞的成熟有促进作用，但浓度过高对卵母细胞成熟就有一定的抑制作用。在牛卵母细胞成熟培养液中添加100 ng/mL的IGF-I显著提高了卵母细胞的成熟率［2］。然而在水牛的成熟培养液中添加30 ng/mL的IGF-I可显著提高卵母细胞的成熟率，当添加浓度增加到100 ng/mL时，卵母细胞成熟率与对照组无显著差异［3］。IGF-I可使山羊无腔卵泡细胞的直径增加，存活力提高［4］。体外成熟培养液添加谷氨酰胺可增强卵母细胞抗氧化作用，提高卵母细胞成熟率和受精后的胚胎发育率［5-6］。然而关于谷氨酰胺和IGF-I对山羊卵母细胞成熟影响的研究还较少。本研究利用6～8周龄晋岚绒山羊羔羊超数排卵获得的未成熟卵母细胞为研究对象，在成熟培养液中添加谷氨酰胺和IGF-I，以探寻山羊卵母细胞成熟培养液中最佳的谷氨酰胺和IGF-I添加浓度，为改善羔羊超数排卵体外生产胚胎的效率提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验羔羊及超排方案 本试验选用6～8周龄、体重相近、营养状况及健康状况良好的12只晋岚绒山羊母羔作为超数排卵对象，于早晨9：00和下午5：00分2次注射FSH 4 mg（BIONICHE Animal Health Canada INC），连续注射2 d，最后1次注射FSH时同时注射PMSG400 IU

（宁波三生药业有限公司）。每次处理2只。试验动物由山西农业大学动物科技学院生态畜牧站提供。

1.1.2 卵母细胞的采集 采用手术活体取卵法。试验羔羊空腹12 h后进行卵母细胞采集。试验前用0.02 mg/kg的静松灵进行麻醉，头部朝下倒置仰卧保定于专用手术架上，局部消毒后，腹部切口打开腹腔，用食指和中指拉出子宫和卵巢，用带有采卵液2 mL一次性注射器从直径大于2 mm卵泡中抽吸，在体视镜下捡出形态正常、胞质均匀的卵丘卵母细胞复合体，记录每只羔羊所获得的可用卵母细胞数。

1.2 卵母细胞的体外成熟培养

在体视镜下将A级卵丘细胞—卵母细胞复合体（COCs）捡出，统计卵母细胞数量。用预热的采卵液（TCM199 9.5 mg/mL，NaHCO32.2 mg/mL，hepes 5.958 mg/mL，BSA 3 mg/mL，heparin 10 μg/mL，2%（v/v）P-S）洗3次，再随机分配到卵母细胞的成熟培养液，用基础成熟液（TCM199 9.5 mg/mL，NaHCO32.2 mg/mL，hepes 5.958 mg/mL，sodium pyruvate 0.3 mmol/L，10%FBS，2%（v/v）P-S）冲洗2次，备用。

试验1：将每次收获的卵母细胞平均分为4份，放入预平衡好的四孔板（成熟培养液600 μL，覆盖石蜡油280 μL），在基础培养液中加入谷氨酰胺，使4个孔中成熟培养液中谷氨酰胺的终浓度分别达到 0、50、100和 150 μg/mL。每孔卵母细胞的数量 25～40个。于38.6℃、5%CO2和100%饱和湿度的CO2培养箱内培养24 h。该试验重复3次。

试验2：培养过程和重复次数同试验1。在含试验1筛选最佳添加浓度谷氨酰胺成熟培养液的基础上，其中3孔分别添加25、50和100 ng/mL的IGF-I，1孔为对照组，不添加谷氨酰胺和IGF-I。

1.3 卵母细胞的成熟鉴定

通过观察卵母细胞形态来判断成熟情况，成熟卵母细胞周围的颗粒细胞扩散，呈放射状。放入0.1%的透明质酸酶中，用玻璃细管反复吹打卵母细胞，至完全除去卵丘细胞为止。拨动卵母细胞进行观察，以排出第一极体（PBI）作为卵母细胞成熟的标志。

1.4 细胞计数及统计分析

试验结束后在体视显微镜下观察记录排出第一极体的成熟卵母细胞的数量，计算成熟卵母细胞所占百分比。数据用SAS软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 卵母细胞的形态学观察

未成熟卵母细胞和成熟卵母细胞形态学分别见图1和图2。图1为未成熟卵母细胞，胞质均匀，外层包裹着3层以上的卵丘颗粒细胞；图2为成熟卵母细胞，在400倍下可以清晰地观察到排出的第一极体。

2.2 培养液中添加谷氨酰胺对卵母细胞成熟的影响

该试验组6只晋岚绒山羊母羔超排共收获可用的COCs 404个，平均每只收获可用67.3个±13.6个。图3结果显示，与对照组相比，成熟液中添加50、100和150 μg/mL谷氨酰胺卵母细胞成熟率分别增加了6.74%、27.74%和11.12%，添加100 μg/mL谷氨酰胺组的成熟率显著高于 50 μg/mL组和 150 μg/mL组（P<0.05），极显著高于对照组（P<0.01）。添加150 μg/mL组显著高于对照组（P<0.05）。由此可知，体外成熟液中谷氨酰胺的最佳添加浓度为100 μg/mL。

图3 培养液中添加谷氨酰胺对卵母细胞成熟的影响

2.3 培养液中添加IGF-I对卵母细胞成熟的影响

该试验组6只晋岚绒山羊母羔超排共收获可用COCs 416个，平均每只收获可用69.3个±7.8个。在含有100 μg/mL谷氨酰胺的体外成熟液中添加不同浓度

的IGF-I对卵母细胞成熟率影响的结果见图4。与对照组相比，成熟液中添加25、50和100 ng/mL的IGF-I卵母细胞成熟率分别增加了8.68%、32.55%和19.71%，添加50 ng/mL和100 ng/mL的IGF-1组的成熟率显著高于25 ng/mL（P<0.05），极显著高于对照组（P<0.01）。添加25 ng/mL组又显著高于对照组（P<0.05）。

图4 培养液中添加IGF-I对卵母细胞成熟的影响

3 讨论

3.1 谷氨酰胺对卵母细胞成熟的影响

氨基酸在卵母细胞体外成熟过程中作用显著，尤其谷氨酰胺是体液中最丰富的氨基酸之一，一直是研究者们研究的热点。谷氨酰胺是L-谷氨酸的羧基酰胺化物，对维持细胞体积，增加细胞内蛋白质合成有一定作用。另外，成熟卵母细胞细胞质中的GSH（谷胱甘肽）浓度可反映卵母细胞细胞质的成熟程度［7］。而卵母细胞GSH合成是以半胱氨酸以及谷氨酰胺作为底物。加入这两种氨基酸不论是对哺乳动物的卵母细胞细胞质的成熟，还是细胞核的成熟都有着很大的益处［8］。本试验结果表明，在一定范围内，随着谷氨酰胺浓度的增加，卵母细胞体外成熟率呈现上升趋势，这一研究结果与目前关于谷氨酰胺的报道相一致［6，9］，并确定了山羊卵母细胞体外成熟液中谷氨酰胺的最佳添加剂量为100 μg/mL。

3.2 IGF-I对卵母细胞成熟的影响

IGF-I在调节卵泡的生长发育方面起着重要作用，在未成熟的卵母细胞和成熟卵母细胞中均有IGF-I和IGF-IR表达［10］。IGF-I的主要功能在于促进由FSH介导的颗粒细胞的分化和增殖，使得卵母细胞的体外活力和生长能力得以提高。但IGF-I对卵母细胞的成熟是有双向作用的，在一定浓度范围内对卵母细胞的成熟有促进作用。本试验结果表明，添加IGF-I浓度在50ng/mL范围内卵母细胞的成熟率呈现上升趋势，与鲁进等在山羊体外成熟培养液中添加20 ng/mL和30 ng/mL的IGF显著提高了成熟率的研究结果一致［11］。然而当IGF-I添加量增加到100 ng/mL时，卵母细胞成熟率低于50 ng/mL组，表明高浓度的IGF-I对卵母细胞成熟有明显的抑制作用。

4 结论

培养液中同时添加100 μg/mL谷氨酰胺和50 ng/mL的IGF-I可以显著提高晋岚绒山羊卵母细胞的体外成熟率。

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doi:10.3969/j.issn.2095-3887.2014.05.008

Effect of Glutamine and IGF-I on the Oocyte maturation of Jinlan Cashmere Goats

ZhangChun-xiang，Qin Xue，Ren You-she，et al
（Animal Science College，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

The objective ofthe study was to investigate the effect of glutamine and IGF-I on oocyte maturation in Jinlan Cashmere goats.Twelve 6-8 week-old Jinlan cashmere female kids were selected to superovulate by FSH injection.The immature oocytes were collected by ovum pick-up,and culture in vitro maturation with supplementation of different concentration of glutamine（0，50，100 and 150 μg/mL）and IGF-I（0，25，50 and 100 ng/mL）in maturation media.The results showed that the maturation rate of oocytes could be significantly improved by adding 100 μg/mL glutamine to the maturation media（P<0.05).After addition 100 μg/mLglutamine，adding50 ng/mLIGF-I could markedlyincrease the rate ofoccytes maturation（P<0.01）.

Jinlan cashmere female kids；oocyte；in vitro maturation；glutamine；IGF-I

S827.3

A

2095-3887（2014）05-0026-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.05.007

2014-08-14

山西省科技攻关计划项目（20110311029）

张春香（1972-），女，副教授，博士，主要从事动物营养与繁殖生理学方面的研究。

任有蛇（1970-），男，副教授，硕士生导师，主要从事动物繁殖方面的研究。