山羊球虫病流行病学调查及应用电脑技术鉴别虫种

阮正祥，龙冬梅，刘 君，何雪锋，刘 江，王芸华，李 竹，杨挺军，陈兴忠，邱声邦，龙厚怡，钱德兴

（1.贵州省毕节市动物疫病预防控制中心，毕节551700；2.贵州省威宁县动物疫控中心；3.贵州省毕节市七星关区动物疫控中心；4.贵州省大方县动物疫控中心；5.贵州省动物疫控中心）

疾病防控

山羊球虫病流行病学调查及应用电脑技术鉴别虫种

阮正祥1，龙冬梅1，刘 君1，何雪锋1，刘 江1，王芸华1，李 竹1，杨挺军1，陈兴忠2，邱声邦3，龙厚怡4，钱德兴5

（1.贵州省毕节市动物疫病预防控制中心，毕节551700；2.贵州省威宁县动物疫控中心；3.贵州省毕节市七星关区动物疫控中心；4.贵州省大方县动物疫控中心；5.贵州省动物疫控中心）

采用饱和盐水漂浮法、麦克马斯特氏法、卵囊培养等方法及应用电脑和配置有彩色数码摄像机的双目光学显微镜设备，在毕节市8个县（区）、24个乡（镇）、26个养殖户（场）开展了山羊球虫病流行病学调查，对339只山羊粪样进行了定性、定量检查和胞子化培养，并应用电脑技术对山羊球虫的卵囊种类进行了鉴别。结果显示，球虫卵囊的感染率96.75%；OPG值在100～472 700枚之间，平均OPG值为8 570枚，鉴别出艾美耳属球虫8种，并对其卵囊的形态学特征进行了详细地描述。调查结果基本反映了当地山羊球虫的感染状况，表明了在电脑上直接观察、记录和测量球虫卵囊的方法比在显微镜下方便，测量也较为准确。

球虫；种类；调查；电脑技术

毕节市畜牧养殖业资源十分丰富，是贵州省畜牧生产大区，草食畜牧业一直处于全省领先地位，特别是1988年6月国务院批准建立毕节地区“开发扶贫、生态建设试验区”及国家西部大开发战略的实施，为毕节市经济腾飞和社会发展提供了千载难逢的历史机遇，毕节市草地资源逐步得到有效利用，草食畜牧业稳步发展。但是由于动物疫病的困扰对毕节市草食畜牧业稳步发展造成了一定的影响，特别是山羊球虫病在本市早已普遍存在，而毕节市山羊球虫病的调查工作基本处于空白，加之贵州省至今尚未见有相关山羊种类调查的报道，所以，防治资料缺乏，对该病一直处于盲目防治状态。为摸清毕节市山羊球虫的感染种类、分布和流行情况，有效地防治山羊球虫病，促进养羊业的健康发展，笔者在进行探索应用电脑技术测量球虫卵囊的基础上［1］，于2012年8月—2013年12月在毕节市的8个县（区）、24个乡（镇）、26个养殖户/场（20/6）进行了山羊球虫病的流行病学调查，并应用电脑技术对山羊球虫的卵囊种类进行了鉴别，以期为山羊球虫病的防控提供参考依据。1自然条件与草食畜牧业概况

毕节市位于贵州省西北部，地处滇东高原向黔中山原丘陵过渡的倾斜地带，下辖7县1区1管理区。境内最

高海拔2 900.6 m，最低457 m，平均1 600 m。全市年均气温12～15.4℃，年均日照时数995.2～1 631.6 h，年均降水量727.3～1 193.2 mm；冬无严寒，夏无酷暑，立体气候突出，适宜多种病源微生物的生长和繁殖。

本市草食畜牧业资源丰富，草山草坡广阔，有牛、马、山羊、鹅、兔等草食动物，其中2013年全市山羊存栏数91.15万只，出栏数47.65万只。山羊主要以放牧加补饲的方式饲养。

2 材料与方法

2.1 实验器材及试剂

双目光学显微镜（XSN-H），专用配置双目光学显微镜的彩色数码摄像机（SCC-101AP，天津三星电子有限公司生产，与电脑联接），电脑，电视/视频实时采集卡1张（装入电脑主机），所有试剂有载玻片、盖玻片、小培养皿、离心机、显微镜二维测量软件CF-200C（上海长方光学仪器有限公司生产，装入电脑主机））、显微镜二维测量软件配带的通用定标尺（用于确定图像尺寸与真实尺寸的比例）、麦氏虫卵计数板（四川省畜牧科学研究院生产），GPS卫星定位仪（Oregon550）等。所用试剂有饱和盐水溶液、饲和蔗糖溶液。

2.2 粪检材料

从毕节市七星关区、大方县、黔西县、金沙县、织金县、纳雍县、威宁县、赫章县等8县区，24个乡镇，26个养殖户/场（20/6）饲养的8 845只山羊中，随机直肠采集粪便样品339只份，每户/场采样时均用GPS卫星定位仪测量经纬度和海拔高度，每只山羊采集粪样10～30 g，并详细登记、逐份编号装入PE塑料自封袋，置4℃冰箱保存待检。

2.3 卵囊定性检查［2］

用饱和盐水漂浮法将采集的339份粪样逐份检查，计算出阳染率。

2.4 卵囊定量检查［2］

对定性检查中呈阳性的328份粪样，用麦氏虫卵计数法逐份检查，计算出每份样品中每克粪便所含卵囊数（OPG），再通过OPG值判定感染程度，其判定标准［1］：ⓐOPG>10×104，为严重感染；ⓑ10×104≥OPG≥1×104，为中度感染；ⓒOPG<1×104，为轻度感染。

2.5 卵囊的收集与培养

取定量检查中OPG值较高的粪样30份，逐份加水捣碎、筛滤、离心沉淀后，向沉淀物加饱和蔗糖溶液漂浮，取漂浮液离心洗去饱和糖水，收集卵囊。将收集到的卵囊移入装有2.5%的重铬酸钾液的培养皿中，置26～28℃温箱中培养至孢子化。

2.6 卵囊的鉴别与测量

根据本文参考文献资料报道的方法和描述作出鉴别。鉴别时在10×40显微镜下将完全孢子化的卵囊形态，通过彩色数码摄像机，导入装置在电脑上的显微镜二维测量软件中，在电脑上观察和记录卵囊形态，测量卵囊的大小（测量时只需将鼠标拉黑所要测量的部位，电脑即可自动显示所测部位实际大小的数据，见图1～9），并在电脑上撷取球虫卵囊显微彩色照片。

3 结果

3.1 卵囊定性检查结果

用饱和盐水漂浮法定性检查粪样339份，检出球虫卵囊阳性的有328份，阳性率为96.75%（见表1）。

表1 山羊球虫卵囊定性检查

3.2 卵囊定量检查结果

用麦克马斯特氏计数法对328份粪样逐份进行定量检查，结果显示：328只山羊粪样的OPG值在100～472 700枚之间，平均每只羊的OPG值8 570枚；其中OPG值在130 000～472 700枚之间的有2只（为严重感染)，在10 000～55 300枚之间的有69只（为中度感染），在100～9 900枚之间的有257只（为轻度感染）［2］。

3.3 卵囊鉴别结果

孢子化卵囊鉴别出艾美耳属球虫8种，分别是克氏艾美耳球虫（Eimeria christenseni）、阿氏艾美耳球虫（E. arloingi）、柯雅艾美耳球虫（E.ninakohlyakimovae）、艾丽艾美耳球虫（E.alijevi）、约奇艾美耳球虫（E.jolchijevi）、阿普艾美耳球虫（E.apsheronica）、山羊艾美耳球虫（E. caprina）、家山羊艾美耳球虫（E.hirci），其感染率分别为 16.67%、80.00%、56.67%、63.33%、46.67%、60.00%、66.67%和73.33%；8种球虫多为混合感染，其中有43.33%的粪样含有5～7种，53.33%的粪样含有2～4种，3.33%的粪样含有1种。现将各种卵囊形态描述如下：

阿氏艾美耳球虫（Eimeria arloingi）（图1-1）：卵囊呈椭圆形或卵圆形，两侧近平行，据对83个卵囊的测量，大小为30.70（26.11～36.42）μm×21.11（18.38～26.95）μm，平均形状指数1.45；囊壁两层，外层光滑，淡绿黄色，厚1.10 μm，内层棕黄色，厚0.55 μm，壁内衬有一层薄膜，呈褐色；极帽淡黄色或无色，宽高为7.31（6.12～9.20）μm× 1.84（1.29～2.76）μm；有卵膜孔，孔边缘有皱褶；有极粒，

无卵囊残体。孢子囊呈长卵圆形，大小为13.73（11.03～17.19）μm×7.16（5.51～9.47）μm，子孢子头尾相邻纵列于孢子囊中；有斯氏体，孢子囊残体呈小颗粒状，分布于子孢子之间。

阿普艾美耳球虫（E.apsheronica）（图1-2）：卵囊呈卵圆形，据对20个卵囊的测量，大小为31.94（27.04～38.07）μm×23.82（20.23～27.40）μm，平均形状指数1.34；囊壁两层，外层光滑，黄绿色或绿色，厚0.73 μm，内层棕黄色或棕红色，厚0.55 μm；无极帽，卵膜孔较小，位于卵囊窄端，孔边缘有皱褶，有的卵囊，卵膜孔可见有一小栓塞；有极粒，无卵囊残体。孢子囊呈长卵圆形，大小为14.69（12.41～17.21）μm×8.75（7.35～9.64）μm，子孢子头尾相邻纵列于孢子囊中；无斯氏体，孢子囊残体由小颗粒组成，分布于子孢子之间。

柯雅艾美耳球虫（E.ninakohlyakimovae）（图1-3）：卵囊呈椭圆形或亚球形，据对33个卵囊的测量，大小为24.56（18.38～30.16）μm×19.96（15.93～24.09）μm，平均形状指数1.23；囊壁双层，外层光滑，淡绿色或淡蓝色，厚0.74 μm，内层棕黄色或棕红色厚0.55 μm；无极帽，卵膜孔不明显，孔边缘有皱褶；有极粒，无卵囊残体。孢子囊呈卵圆形，大小为11.58（9.12～14.50）μm×7.08（6.13～8.81）μm，子孢子头尾相邻纵列于孢子囊中；有斯氏体，孢子囊残体由小颗粒组成，分布于子孢子之间。

家山羊艾美耳球虫（E.hirci）（图1-4）：卵囊呈短椭圆形或亚球形，据对31个卵囊的测量，大小为26.50（22.05～32.47）μm×21.68（17.77～25.23）μm，平均形状指数1.25；囊壁两层，外层光滑，淡黄绿色，厚0.86 μm，内层棕黄色，厚0.50 μm；极帽淡黄色或无色，宽高为5.76（3.86～7.17）μm×1.40（1.10～2.40）μm；有卵膜孔，有极粒，无卵囊残体。孢子囊呈宽卵圆形，大小为11.00（9.56～15.93）μm×7.60（6.13～8.88）μm，子孢子横向排列于孢子囊中；斯氏较小，孢子囊残体由小颗粒组成，分布于子孢子之间。

艾丽艾美耳球虫（E.alijevi）（图1-5）：卵囊呈亚球形或球形，据对30个卵囊的测量，大小为20.96（15.26～25.73）μm×19.08（12.32～23.54）μm，平均形状指数1.10；囊壁两层，外层光滑，淡蓝色或绿色，厚0.98 μm内层棕黄色或褐色，厚0.55 μm；无极帽，无卵膜孔，有极粒，无卵囊残体。孢子囊呈长卵圆形，大小为9.90（8.25～12.69）μm×6.51（5.21～7.74）μm，子孢子头尾相邻纵列于孢子囊中；有斯氏体，孢子囊残体呈小颗粒状，分布于子孢子之间。

克氏艾美耳球虫（E.christenseni）（图1-6）：卵囊呈卵圆形，据对34个卵囊的测量，大小为41.45（36.71～44.75）μm×26.96（26.151～30.20）μm，平均形状指数1.50；囊壁两层，外层光滑，淡绿色或黄绿色，厚1.10 μm，内层棕黄色或棕红色厚0.74 μm，壁内衬有一层薄膜，呈褐色；极帽淡黄色或无色，宽高为6.77（4.9～7.55）μm× 1.96（1.66～2.21）μm；有卵膜孔，孔边缘有皱褶；有极粒，无卵囊残体。孢子囊呈宽卵圆形，大小为14.38（12.86～16.09）μm×9.58（8.57～12.07）μm，子孢子头尾相邻纵列于孢子囊中；有斯氏体，有时不明显，孢子囊残体呈小颗粒状，分布于子孢子之间。

约奇艾美耳球虫（E.jolchijevi）（图1-7）：卵囊呈壶形或罐形，据对27个卵囊的测量，大小为30.63（26.90～37.86）μm×22.22（16.61.～26.15）μm，平均形状指数1.38；囊壁两层，外层光滑，淡黄绿色或淡绿色，厚0.92μm，内层棕黄色或棕红色，厚0.55 μm；极帽淡黄色或无色，位于卵囊的宽端，宽高为7.45（5.57～9.01）μm× 1.30（1.10～1.83）μm；有卵膜孔、有极粒，无卵囊残体。孢子囊呈卵圆形，大小为11.94（10.35～14.77）μm×8.00（6.93～9.60）μm，子孢子头尾相邻纵列于孢子囊中；斯氏体明显，孢子囊残体由细小的颗粒组成，呈团状，分布于子孢子之间。

山羊艾美耳球虫（E.caprina）（图1-8）：卵囊呈椭圆形或略呈卵圆形，据对34个卵囊的测量，大小为33.52（25.82～42.67）μm×24.70（18.37～33.66）μm，平均形状指数1.36；囊壁两层，外层光滑，黄绿色，厚0.92 μm，内层棕红色或棕黄色，厚0.55 μm；无极帽，卵膜孔宽而明显，边缘有皱褶；有极粒，无卵囊残体。孢子囊呈长卵圆形，大小为15.15（11.03～17.16）μm×8.55（7.19～9.80）μm，子孢子头尾相邻纵列于孢子囊中；有斯氏体，孢子囊残体由小颗粒组成，分布于子孢子之间。

图1 山羊球虫种类显微照片（10×40）

4 讨论与小结

1）本次调查结果显示，毕节市山羊球虫不仅感染率高，种类多，且多为混合感染，其感染率高达96.75%，感染强度在100～421 700枚卵囊之间；感染种类有8种艾美耳球虫，其中感染5～7种的有43.33%，感染2～4种的有53.33%。究其原因，与当地的饲养管理方式和自然生态环境密切相关。毕节市山羊均以放牧为主，羊只在河边、塘边、沟壑、草山草坡随地便溺，给球虫的感染和传播造成了良好机会；另外毕节市地形复杂，地势西高东低，呈阶梯状下降，垂直变化明显，形成了中温带、南温带、北亚热带、中亚热带等立体气候类型，冬无严寒、夏无酷署，为球虫的体外发育提供了广泛的生态选择，利其生长发育。

2）这次调查共鉴别出8种艾美耳属球虫。据文献资料报道［3-9］，能致病的山羊球虫主要有克氏艾美耳球虫（Eimeria christenseni）、阿氏艾美耳球虫（E.arloingi）、柯雅艾美耳球虫（E.ninakohlyakimovae）、艾丽艾美耳球虫（E.alijevi）。本次调查证明这4种球虫在8个县（区）、24个乡（镇）、26个养殖场/户的羊只中均有存在，其感染率分别为16.67%、80.00%、56.67%和63.33%，建议在每年的春夏秋期间，选用地克珠利或盐酸氨丙啉（两种药物交替使用，以免产生耐药性）、各进行一次预防性驱虫，同时加强圈舍、粪便和环境卫生的管理。笔者用这两种药物做过山羊球虫病防治药物分组比对试验，地克珠利用药后，球虫卵囊的减少率为99.74%。盐酸氨丙啉用药后，球虫卵囊的减少率为88.77%。两种药物均由江苏南京农大动物药业有限公司张宝康老师介绍提供，并在其指导下使用。使用方法为两种药物均按1 kg体重0.25 g，均匀搅拌于精饲中饲喂，1日1次，连用4日。

3）据对定性检查的339份和定量检查的328份山羊粪便样品的检查结果分析：就羊群间的感染情况看，其总感染率96.75%（328/339），平均感染强度8 570枚；就羊只年龄间的感染情况来看，半岁以下羊只的感染率为99.18%（121/122），平均感染强度为9 173枚，半岁以上感染率95.39%（207/217），平均感染强度8 216枚；就危害程度来看，严重感染［2］的羊2只（OPG值在130 000～472 700枚之间)，中度感染羊有69只（OPG值在10 000～55 300枚之间)，轻度感染的羊有257只（OPG值在100～9 900枚之间的)；就自然环境海拔高度看，海拔高度在1 202～1 763 m的感染率97.50%（195/200），平均感染强度7 058枚，海拔高度在1 963～2 445 m的感染率95.68%（133/139），平均感染强度10 785枚。这一系列的结果显示，毕节市的山羊球虫感染普遍，且半岁以下羊的感染率和平均感染强度均高于半岁以上的羊。虽然大多数的羊只仅属于轻度感染，但防治工作不容忽视，应引起各级有关部门和防治机构的足够重视，制定防治方案时也应充分考虑到上述各个方面的因素。

4）本文所采用的应用电脑技术鉴别球虫卵囊的方法，与笔者已发表［1］文章中的方法相比，仅在测量卵囊大小的工具上有所改进。本文所用测量工具为显微镜二维测量软件，按照软件说明书定标（确定图像尺寸与真实尺寸的比例）后，只需将鼠标拉黑所要测量的部位，电脑即可自动显示所测部位实际大小的数据（见图1-9）；《探索》一文中所用测量工具为屏幕直尺，而屏幕直尺仅相当于目镜测微尺，在电脑显示屏上测量卵囊时，所得的数据还要通过再次人工换算才能得到所测部位的实际大小。两者相比，在测量卵囊时，测量软件比屏幕直尺更为精确和方便，但测量软件需投入资金，而屏幕直尺在网上可免费下载。总之两种方法都比在光学显微镜下测量卵囊更加方便和准确，并且直接在电脑显示屏上撷取到的球虫卵囊彩色照片与在显微镜下观察到的形态、结构和颜色基本一样，与以往采用人工描绘的卵囊形态结构模式图相比更为直观，对卵囊的鉴别有一定的参考价值。

5）本次调查范围广，面积大，调查结果基本上反映了毕节市山羊球虫种的感染状况，为制定羊球虫病的防治方案提供了一定的科学依据。

［1］阮正祥，陈兴忠，何雪锋，等.山羊球虫种类调查与电脑技术应用于卵囊测量方法的探索［J］.中国动物传染病学报，2011，19（6）：44-48.

［2］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T18647-2002动物球虫病诊断技术［S］.北京：中国标准出版社，2002.

［3］卫九健，张晓东，张子军，等.河南及重庆、部分地区山羊球虫感染情况与种类调查［J］.中国草食动物科学，2012，32（6）：34-38.

［4］孙志辉，章孝斌,刘峻，等.羊场山羊球虫感染情况调查研究［J］.现代农业科技，2010（18）：297-298.

［5］杨智青，丁海荣，陈应江，等.江苏沿海地区山羊球虫病发生机制及防治策略［J］.安徽农学通报，2010，16（21）：125-126.

［6］陶立，韦志锋，兰美益，等.广西圈养山羊球虫种类和感染状况的调查［J］.畜牧与兽医,2011,43（4）：82-85.

［7］张玲，孔志园，郑娟，等.洛阳郊区山羊球虫种类及感染现状调查［J］.畜牧与兽医，2011,43（4）：108-110.

［8］林锐，李金虎，高俊峰，等.黑龙江省部分地区绵羊与山羊球虫种类调查与形态描述［J］.养殖技术顾问,2010（5）：209-210.

［9］彼得L朗.球虫生物学［M］.蒋金书，译.南宁：广西科技出版社，1990：14-15.

Application of Computer Technology in Identification of Goat Coccidiosis Species

Ruan Zheng-xiang，LongDong-mei，Liu Jun，et al
（Bijie Center for Animal Disease Control，Bijie 551700，Guizhou，China）

A total of 339 goat fecal specimens were collected in Bijie city of Guizhou Province and examined for the presence of coccidian oocysts by using floating method,McMaster's method and oocyst cultures.A color digital camera with binocular optical microscope was linked to a computer so that observation,recording and measurement of coccidian oocysts could be completed on the computer screen.The positive rate of coccidian oocysts was 96.72%and OPG ranged from 100 to 472 700（average 8 570）. Eimeria tenella was identified in 8 fecal specimens and the morphology of their oocysts was described.These results demonstrated that the direct observation,recordingand measuringoocysts on the computer were more convenient than under the microscope not only,but alsomore accurate.

Eimeria;species;survey;computer technology

S827.7

A

2095-3887（2014）02-0039-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.02.013

2014-02-17

阮正祥（1955-），男，高级兽医师，兽医专业。