液固态混菌发酵生产蛋白饲料的研究

陈书明

（三门峡职业技术学院 食品园林学院，河南 三门峡 472000）

技术与应用

液固态混菌发酵生产蛋白饲料的研究

陈书明

（三门峡职业技术学院 食品园林学院，河南 三门峡 472000）

利用苹果渣为原料，通过炭黑曲霉和产朊假丝酵母的液固态混合发酵，制备苹果渣多酶蛋白饲料。 研究表 明 ：液 体 培 养 的 重 要 参 数 是 温 度 28℃ 、 接 种 量 12%、 蔗 糖 添 加 量 15g、 转 速 180r/m in， 时 间 72h；液 体 培 养 产 物 短 期 储藏，10℃效益高，长期储藏，2℃～5℃效果好；固体发酵的最优发酵条件是：接种量 10%～14%，培养时间为 5～6d。 发酵产物 中 粗 蛋 白 、真 蛋 白 质 量 分 数 分 别 提 高 了 103.1%、165.76%， 粗 纤 维 、 还 原 糖 则 降 低 了 42.51%、53.62%， 纤 维 素 酶 活 力 增加 了 3000U/g，果 胶酶活 力增 加了 50000U/g。 该方 法生 产的饲 料蛋 白符合 企业 植物发 酵蛋 白质饲 料标 准。

液固态发酵；苹果渣；蛋白饲料

苹果渣是苹果汁加工业的副产物，有高度的可生物降解性，会导致腐烂发臭的味道，影响水资源和生态系统，因此需要寻找合理的资源化利用途径。 研究发现以苹果渣为主要基质原料，采用固态发酵技术可较大幅度地提高物料蛋白质含量。但人们多致力于提高苹果渣的蛋白质含量，很少涉及抗营养因子的降解与低分子糖类的转化；其次，存在如菌体生长较慢，种子培养基用量大，发酵时间长等问题，很难进行规模化生产。

本文采用两株高产酶菌株对苹果渣进行液固态混菌发酵生产多酶蛋白饲料，对生产工艺进行了优化，对纤维素的生物降解、蛋白质和酶含量的提高水平等进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

苹果渣：河南缘份果业有限公司；炭黑曲霉（编号：41254）、产朊假丝酵母（编号：31923）购于中国工业菌种保藏管理中心。

1.2 试验方法

1.2.1 蛋白饲料的制备

（1）黑曲霉的扩培：

①活化：将保存的黑曲霉接到马铃薯培养基的摇瓶中，100-120r/min、28℃培养。

②一级扩培：将活化后的菌液画线到改良马丁琼脂斜面上，28℃培养静置培养。

③二级扩培：取一级扩培时典型菌落接种到培养基中，28℃，120r/min 培养。

二级扩培培养基：蛋白胨 3.0g；干果渣 5g，磷酸氢 二 钾 1.0g； 酵 母 浸 出 粉 2.0g； 氯 化 钙 0.5g； 葡 萄 糖20.0g；H2O1L。

（2）产朊假丝酵母的扩培：

①菌种活化：将保存的产朊假丝酵母接种到50Be'麦芽汁培养基中，90r/min，30℃培养 4d。

②扩培培养： 活化后的菌种接种到 YPD 培养基上，90r/min，30℃培养。

（3）液体培养（此阶段为炭黑曲霉与穿软假丝酵母的混合培养）：

把菌体调成浓度为 2×108/L， 按照 5%-10%的接种量接入。

液态发酵培养基：干苹果渣 25g，蔗糖 10-20g，蛋白胨 3g，CaCl20.5g，酵母浸出粉 2.0g，KH2PO41g。 水1000mL。 90-180r/m，24-32℃培养 4d。

（4）固体发酵：

干 苹 果 渣 500g， 麸 皮 100g， 尿 素 10g，KH2PO410g，水 700ml。 分 装 于 4 个 5L 的 锥 形 瓶 中 。每个瓶中加（3）培养后的 60、100、140ml菌液，24℃培养 6d。

固体发酵结束，把发酵产物 50℃干燥至恒重。

1.2.2 生长曲线绘制：

（1）炭黑曲霉生长曲线

将装有 50ml培养液的试管封口后置于振荡培养箱中，在 28℃，90r/min 条件下培养，每 4h 取样一次，共培养 36h。 将样品试管培养物抽滤，然后将培养物附带滤纸 （滤纸在抽滤前进行称量， 质量标记为 m′）一起置于烘 箱中 105℃干燥置恒重，最 后用电子天平对其进行称量，质量标记为 m。 黑曲霉菌丝的干重M按照公式：

M=m-m′，计算。 以培养时间为横坐标，炭黑曲霉的干重为纵坐标绘制炭黑曲霉的生长曲线（图 1）。

（2）产朊假丝酵母生长曲线 在扩增培养时，每 3h 取样一次，共取样 8 次，测定其在 600nm 下的吸光值，绘制种子生长曲线（图 2）。本试验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与混浊度成正比，因此，可利用分光光度计测定细菌悬液的光密度来推知菌液的浓度。 将所测得的光密度值（OD600）与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线。

1.2.3 菌体和孢子计数：

根据菌体生长曲线，选择对数生长期的菌种进行菌落计数。方法是将扩培结束的炭黑曲霉和产朊假丝酵母经过梯度稀释，通过稀释平板菌落计数法检测菌活数。

1.2.4 正交试验设计

选取影响菌体生长的重要因素即温度、接种量、转速、蔗糖添加量 4 个因素，各取 3 个水平，测定液体培养过程中菌体数量，进行 L9（34）正交设计试验，正交设计因素和水平见表 1。

表1 液体培养的正交设计因素和水平

1.3 干饲料的理化测定：

粗 蛋 白 的 测 定 采 用 双 缩 脲 法[1]。

真 蛋 白 的 测 定 采 用 改 进 的 微 量 凯 氏 定 氮 法[2]。称取固态发酵产物 5g，用 40mL 体积分数 75%的乙醇浸提 24h，充分搅 拌、抽滤，滤渣 再 用 40mL 体积分数 75%的乙醇反复洗涤 2 次，以洗去无机氮和尿素，同时沉淀蛋白质。 将沉淀物于 60℃下干燥至恒量，再用微量凯氏定氮法测定。

还原糖含量的测定 沸煮 30min，过滤，重复 3次，合并滤液，再用费林法对溶液测定。

粗 纤 维 含 量 的 测 定 采 用 过 滤 法[3]。

灰 分 含 量 的 测 定 用[4]。

纤维素酶活力测定采用 3，5-二硝基水 杨 酸 法[5]。

果 胶 酶 活 力 采 用 黏 度 法[6]。

2 试验结果与分析

2.1 种子生长曲线

由图 1 可知，在 0-8h，炭黑曲霉干重增加缓慢，这说明该阶段为孢子的萌发期，8-16h，干重迅速增加，之后干重值变化趋于平坦，这说明 8-16h 为炭黑曲霉的对数生长期，16-36h 为稳定期。 在发酵过程中，为缩短菌体的适应时间，选择炭黑曲霉菌体繁殖最快，菌体最强壮的对数生长期末期的菌体进行液体培养接种。

图1 炭黑曲霉生长曲线

由图 2可知， 产朊假丝酵母在培养的最初 6h生长缓慢， 之后到 12h 这段时间生长迅速，12-24h这段时间菌液的吸光度几乎没有变化。这说明在培养的前 5h是菌体的适应阶段， 之后进入快速生长阶段，是菌体的对数期生长期，此后，菌体进入稳定期和衰亡期，但是由于由于光密度表示的是培养液中的总菌数，包括活菌与死菌，因此所测定的生长曲线的衰亡期不明显，另外，如果菌体衰亡的特别多，菌体会破裂，这时吸光度值会减小的，因此说明该阶段可能只是菌体的稳定期，检测没有进行到衰亡期。

图2 产朊假丝酵母生长曲线

2.2 培养条件对液体培养期菌种生长的影响

2.2.1 正交试验结果与分析

在表1所确定的主要影响因素和水平的基础上，按 L9（34）正交表进行正交试验，测定培养液中菌体数量。 正交数据分析结果见表2。

表2 液体培养的正交试验结果和直观分析表

从表 2 的 R 值可知，A＞D＞C＞B， 对菌体数量影响最大的因素是温度，其次是蔗糖量，接种量相对较小 ，转 速 影 响 最 小 。 最 优 水 平 组 合 结 果 为 A2B2C3D2。而这个最优水平组合在正交试验过程中是没有进行的，因此需要进一步的验证。 在进行验证试验时，只对影响菌体数量的主要因素进行验证，转速作为影响最小的因素，不再验证。

2.2.2 培养温度对菌体生长的影响

根据正交试验结果，设定菌体的培养温度为26、28、30℃，接种量取 10%，蔗糖量取 15g，转 速 取180_r/min。 在培养的 48h、72h、96h 进行取样，通过平板菌落计数。

图3 培养温度对菌体生长的影响

图 3 显示，在 26、28℃培养条件下，随着培养时间的延长，培养基内的菌体数量增加，总体呈上升趋势。 30℃条件下，开始的前 72h 菌体数量呈上升趋势，但是，随着培养时间的延长菌体数量呈下降趋势，96h 检测时与 72h 相比，下降近 7%。 这可能是由于刚开始时由于各种营养物质充足，在适度较高的情况下有利于菌体的繁殖，后来随培养时间的延长，培养液内积累了大量的菌体，但此时培养基内的营养物质因逐渐消耗而不能满足所有菌体的需要，从而导致一部分菌体的死亡。 在培养的 96_h内，28℃较 26℃能培养更多数量的菌体， 所以最适的液体培养温度是 28℃。

2.2.3 接种量对菌 体生长的影响

根据正交试验结果，设定菌体的接种量设为8%、10%、12%，培养温度为 28℃，蔗糖量取 15g，转速取 180r/min。 在培养的 48h、72h、96h 进行取样，通过平板菌落计数。

图4 接种量对菌体生长的影响

接种量的多少直接影响到菌种的生长速度。接种量小培养时间就要延长，由于目的菌群数量不足还容易感染杂菌，同时菌丝体容易抱团生长导致团中心缺氧而导致菌体数量增长缓慢；接种量大，如果培养时间过长将会导致菌体产生较多的有害物质，对菌体的生长是不利的。

由图 4 可知，8%、10%的接种量使液体培养时的菌体数量在培养的 96小时内呈增加趋势， 在接种后的 72h 内，12%的在接种后 72h 呈增加趋势，之后呈下降趋势。 8%的接种量虽然整体呈增加趋势，但总量低于 10%，可能的原因是炭黑曲霉再生长过程中由于接种量小而抱团生长，再培养基内溶氧量不高的情况下菌团中间的菌体很难获得足够的氧气而导致整体的菌体数量增加不多。 10%的接种量菌丝体呈分散状生长，菌体缺氧现象不明显。12%的也呈分散状生长， 但是由于后期液体发粘，溶氧量下降， 导致在 72-96h 的这段时间内有部分菌体因缺氧而死亡。

在培养的 96h 内，接种量为 8%、10%、12%三者中，12%的接种量培养 72h 时菌体数目最多， 说明最好的接种量为 12%，培养时间是 72h。

2.2.4 蔗糖添加量对菌体生长的影响

根据正交试验结果，设定菌体的蔗糖添加量设为 13、15、17，培 养 温 度 为 28℃，接 种 量 取 12%，转速取 180r/min。 在培养的 48h、72h、96h 进行取样，通过平板菌落计数。

图5 蔗糖添加量对菌体生长的影响

图 5 显示，在培养的前 72h，添加 13、15、17g 蔗糖对菌体数量影响不明显，在 72-96h，添加 17g 的菌体数量多于 13、15g 的， 并且培养基中添加 13、15g 的 ，菌 体数 量 有 所下 降 ，17g 的菌 体 数 量 变 化 不明显。 这表明培养基中添加 17g蔗糖效果最好。

2.3 存储条件对液体培养产物的影响

把炭黑曲霉和产朊假丝酵母液体混合培养后，所得的菌体与培养基的液体混合物将作为进一步苹果汁固体发酵的发酵剂。 在实际生产中，发酵剂制备好后通常需要存储和流通后被使用，因此研究存储条件对发酵剂的有效使用是非常必要的。

因为刚制备好的发酵剂中的菌处于生理活性很旺的状态，要使发酵剂能长期保存，必须使菌体生理活性降低而又不死亡，其中温度是关键。 设定储藏温度分别为 2℃、5℃、10℃， 保藏 7、14、30d 后用平板菌落计数法测定菌体数量（发酵剂制备后迅速降温至设定温度进行试验）。

图6 存储条件对菌体的影响

由图 6 可知，在 2、5℃的条件下，发酵剂内菌体数量变化趋势不明显，10℃的条件下， 菌体数量变化呈下降趋势。 在存储的前 14d，10℃与 2、5℃的菌体数量差异不大，之后 10℃的明显低于 2、5℃的。这说明 10℃条件下适合短期存储，2、5℃的条件适合长期存储，考虑到制冷对能耗的消耗，长期存储在5℃下是最合适的。

2.4 固体发酵条件的确定

接种量的减少意味着生产便利和发酵产量的增加，应该在允许的范围内尽可能降低接种量。 但太少的接种量会使发酵时间延长，蛋白质量分数降低，同时发挥不了菌种优势，容易感染其他杂菌，产生异味，影响产物品质。

图7 接种量和发酵时间对粗蛋白含量的影响

图 7 显示，随着接种量的加大，粗蛋白含量呈递增趋势；随培养时间的延长，粗蛋白含量也呈递增趋势；接 100m l发酵剂与接 140ml发酵剂在培养 6d 的情况下粗蛋白质量分数相差不大，接 60m l发酵剂在培养时粗蛋白质量分数与 100、140 相比差异较大。由此可知，接 100m l或 140ml发酵剂是比较适合。

发酵时间对生产至关重要，时间短，达不到理想的蛋白质量分数，而太长，则生产周期与成本增加。图7显示底物粗蛋白质量分数的动态变化。即随发酵的进行，粗蛋白质量分数均迅速上升。 在接种量为 100、140ml的情况 下 ， 发 酵 的 4d 与 5d 相比，粗蛋白的质量分数显著增加，发酵 5d 与 6d 差异不显著。 综合考虑发酵时间、接种量、成本等多种因素，当接种量为 100ml时，发 酵 6d 效果较 好，接种量 140m l时，发酵 5d 效果较好。

2.5 发酵产物主要成分测定和分析

对发酵原料和产物进行主要成分测定，结果如表 3 所示。 由结果可知：以苹果渣为主要原料，经液固态混合发酵后，产物的主要成分发生明显变化。粗 蛋 白 、 真 蛋 白 质 量 分 数 分 别 提 高 了 103.1% 、165.76%，粗纤维、还原糖则 降低了 42.51%、53.62%，纤维素酶活力增加了 3000U/g， 果胶酶活力增加了50000U/g。 蛋白质含量符合福建科佳奇迈生物工程有限公司的植物发酵蛋白质饲料标准[7]。

S816.4

：B

：1671-9123（2014）03-0106-04

2013-07-07

三门峡职业技术学院横向合作项目（SZY-2013-019）

陈书明（1980-），女，河南许昌人，三门峡职业技术学院食品园林学院讲师。