响应面法优化超声提取葛根素工艺

邱 远，芮 昕，谢翌冬，李 伟，陈晓红，姜 梅，董明盛*

（南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095）

响应面法优化超声提取葛根素工艺

邱 远，芮 昕，谢翌冬，李 伟，陈晓红，姜 梅，董明盛*

（南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095）

利用响应面法优化超声提取葛根露酒中葛根素工艺。将葛根露酒进行超声波处理，缩短葛根露酒的浸泡时间，对超声波工艺条件进行优化，利用单因素试验和响应面法对浸泡时间、超声功率和超声时间3个工艺参数进行优化。结果表明，最佳的工艺参数条件为：浸泡时间22 h、超声功率120 W、超声时间12 min，此条件下的葛根素浸出量可达89.6 mg/g。

葛根；葛根素；葛根露酒；超声波；响应面法

葛根，又名野葛、甘葛、黄斤等，是豆科属藤本植物葛的肥大块根，广泛分布在中国、日本、韩国等地，在我国已有6 000多年的栽培历史[1-2]。葛根除了是常用的中药药材，而且还具有极高的营养保健价值。葛根素是葛属植物所特有的黄酮类物质[3]，它又称为葛根黄酮，全名8-β-D-葡萄吡喃糖-4’,7-二羟基异黄酮[4]。研究表明，葛根素能增强心肌的收缩力，保护心肌细胞[5-7]，降低血压[8]，改善眼部血管微循环[9]，增强机体的造血功能[10]，对肾、心脏与肝脏具有一定的保护作用，还能够抑制癌细胞的转换[11]，增强学习记忆能力[12-13]，清除氧自由基和抗氧化性损伤[14-16]，降低血浆中儿茶酚胺的含量，调节一氧化氮合酶活性，提升体内NO水平[17]。

超声波指的是频率高于20 000 Hz的声波，是一种机械振动的传播过程，具有方向性好，穿透能力强等优点[18]。现代社会中，超声波被广泛应用于金属探伤[19]、水下定位、诊断疾病、工业生产[20]、环境保护、生物工程[21]等领域。超声波提取是一种利用超声波的机械振动与空化作用来促使植物的有效成分的浸出方法[22]。超声波在机械振动的时候能够产生传递能量，促使植物的有效成分加速进入溶剂中。空化作用就是当液体中在存在巨大的破坏力的时候，液体内部会形成空化泡的现象[23]。空化泡在破裂时将把泡内的能量全部释放，产生瞬时的高温和高压，引起细胞壁的破坏，从而使得细胞内的物质直接浸出并与溶剂充分混合，提高物质的提出率[24]。研究表明，从黄芩[25]、槐米、山楂[26]、五加皮以及陈皮[27]等植物中提取黄酮类物质，使用超声波提取之后，提取率都得到了巨大的提高。

将超声波技术应用于植物各种成分的提取，必有广阔的应用前景。超声波提取法与诸多传统的提取工艺相比，不仅显著提高细胞物质的溶出速度、缩短提取的时间，而且提出率很高。我国葛根资源丰富，区域成本不高，具有数量优势、质量优势等经济价值的优势。目前，我国葛根开发的主要困难是缺乏先进的技术、产品形式比较单一。如将葛根与酒结合，不仅能发挥葛根与酒的各自的优点，更有利于中国酒文化在今后的发展。开发葛根药酒对我国葛根资源利用率不高的现状具有现实意义。葛根和药酒在我国都具有很大的市场潜力，开发研制葛根酒，辅以超声波提取技术，不仅为葛根，也为药酒的现代化工业化提供了新的思路，具有十分广阔的市场前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葛根块 江苏省句容市中苏容生态农副产品发展有限公司生态农业产业园；食用酒精 江苏省味研食品有限公司；葛根素标准品（＞98%） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

电子天平 浙江凯丰集团有限公司；高效液相色谱仪 美国Agilent 技术公司；LRH-150型生化培养箱上海益恒实验仪器有限公司；超声波清洗仪 江苏垒君达有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葛根露酒的提取

采用预实验得到的提取葛根素的最佳条件为根与基酒的固液比为1∶25（g/mL），基酒为体积分数55%的食用酒精，然后进行超声波处理，静置一段时间后测定葛根素含量。

1.3.2 葛根素含量的测定

采用高效液相色谱法，色谱柱：C18柱（150 mm×4.6 mm，5 øm）；流动相A：甲醇，流动相B：水；洗脱条件：流动相A∶流动相B = 75∶25（V/V）；检测波长：249 nm；柱温：40 ℃；流速：0.8 mL/min；进样量：20 øL。

以葛根素标品做标准曲线，所得的回归方程为y=107.1x＋364.6（R2=0.999）。y为葛根素标品峰面积；x为葛根素质量浓度/（μg/mL）。

1.3.3 单因素试验

挑选外观良好的、大小均匀的葛根块，称取4 g，加入100 mL的体积分数55%的食用酒精中，超声功率140 W条件下超声15 min，室温浸泡24 h后测定其中葛根素的含量。固定其他条件，分别考察浸泡时间（4、8、12、16、20、24、48、72、96 h）、超声功率（100、120、140、160、180、200 W）、超声时间（5、10、15、20、25、30 min）对葛根素的含量的影响。每组试验重复3次。

1.3.4 响应面试验

根据单因素试验结果，选取浸泡时间、超声功率、超声时间因素，以葛根素浸出含量为响应值，根据Box-Behnken试验设计原理，设计3因素3水平响应面试验，见表1，每组重复3次。

表1 Box-Behnken试验设计因素水平及编码Table 1 Factors and their coded levels used in Box-Behnken design

1.4 数据处理

采用Design Expert 7.0软件处理，并进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 浸泡时间对葛根素浸出量的影响

图1 浸泡时间对葛根素浸出量的影响Fig.1 Effect of soaking time on the extraction efficiency of puerarin

由图1可知，超声处理之后，在开始的24 h以内，葛根素浸出量随着浸泡时间的延长而增加，24 h以后，葛根素的浸出量稳定，浸泡时间的延长不会引起葛根素浸出量的变化，故选择24 h作为葛根露酒的浸泡时间。

2.1.2 超声功率对葛根素浸出量的影响

图2 2 超声功率对葛根素浸出量的影响Fig.2 Effect of power of ultrasonic power on the extraction efficiency of puerarin

由图2可知，葛根素浸出量随着超声功率的变化而变化，当超声功率低于120 W时，葛根素未能够浸提完全，而当超声功率高于120 W时，葛根素浸出量随着超声功率的增加而减少。其原因可能是超声功率过大引起葛根细胞里面一些分解葛根素的酶内物质浸出，从而引起葛根素浸出量的降低，故超声功率的最后选择为120 W。

2.1.3 超声时间对葛根素浸出量的影响

图3 超声时 间对葛根素浸出量的影响Fig.3 Effect of ultrasonic treatment time on the extraction efficiency of puerarin

由图3可知，葛根素浸出量随着超声时间的变化而变化，当超声时间低于15 min时，葛根素浸出量随着超声时间的延长而增加，而当超声功率高于15 min时，葛根素浸出量随着超声时间的延长而降低。结果分析原因可能是超声时间过长，导致葛根细胞里面一些分解葛根素的酶内物质浸出，从而引起葛根素浸出量的降低，故超声时间的最终选择15 min。

2.2 响应面分析法优化葛根露酒的超声提取工艺

2.2.1 Box-Behnken试验设计及结果

根据三因素三水平的响应面试验设计一共选择试验点17个，其中12个析因点、5个零点，方案与结果见表2。

表2 Box-Behnken试验设计与结果Table 2 Box-Behnken design and experimental results

2.2.2 回归模型的建立与显著性分析

用Design Expert 7.0软件对表2中的数据进行分析，得出3个影响因素与葛根素浸出量之间的二次回归方程：Y=87.94-1.44A＋0.15B-7.16C-0.43AB-0.2AC-1.33BC-1.42A2-4.85B2-5.27C2。

从表3可以看出，模型的P值远远小于0.01，这说明该模型极显著，与试验拟合较好。本试验中的决定系数R2=0.964 9，说明葛根素浸出量的结果与模型回归值有着良好的一致性。模型校正系数R2Adj=0.919 8，说明试验结果有91.98%受到所选因素的影响。失拟项F=0.142 7＞0.05，失拟项不显著，说明该方程能够充分反映实际情况。因此，此模型可以用来 预测超声条件对葛根素浸出含量的影响。回归方程各项的方差分析结果表明，各因素对葛根素浸出量的影响次序为：超声时间＞浸泡时间＞超声功率。

表3 拟合二次多项式模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model

2.2.3 响应面分析

利用Design Expert软件对表2的数据进行二次多元回归拟合，所得到的二次回归方程的响应面及其等高线图如图4所示。从图4a可以看出，随着超声功率的加强和浸泡时间的延长，葛根素浸出量先增高后降低；从等高线图可以清楚的看出，浸泡时间所对应的等高线更陡，说明相对于超声功率来说，浸泡时间的影响更显著。图4b、c表明随着超声时间、浸泡时间和超声功率的延长，葛根素浸出量先增高后降低；超声时间对葛根素浸出量的影响大于浸泡时间（图4b），而超声时间对葛根素浸出量的影响大于超声功率（图4c）。

图4 两因素交互影响响应面及等高线图Fig.4 Response surface and contour plots for the interactive effects of three process parameters on the extraction efficiency of puerarin

2.2.4 超声工艺的优化组合及其验证

根据Box-Behnken试验设计所得结果和二次多项式方程，利用De sign-Expert软件计算出最佳超声工艺条件，葛根露酒的最佳超声工艺条件为：浸泡时间22.1 h、超声功率122.60 W、超声时间11.56 min。为了便于操作，将以上条件参数做微小的修正：浸泡时间22 h、超声功率120 W、超声时间12 min。根据改修正的工艺条件，经过5次验证实验，葛根露酒的葛根素浸出量可以达到89.6 mg/g，与理论值相比，降低了1.28%，可见该模型较好的预测了实验结果。

3 结 论

本实验通过单因素试验分析了葛根露酒生产过程中最佳的超声波条件。采用Box-Behnken试验设计与响应面分析，建立了超声工艺的二次多项式数学模型。经过验证实验证明是有效的，能够有效的预测葛根素浸出量。最后确定最佳的超声工艺条件：浸泡时间22 h、超声功率120 W、超声时间12 min，在此条件下，葛根露酒的葛根素浸出量可以达到89.6 mg/g。

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Optimization of Ultrasound Extraction Process of Puerarin by Response Surface Methodology

QIU Yuan, RUI Xin, XIE Yi-dong, LI Wei, CHENG Xiao-hong, JIANG Mei, DONG Ming-sheng* (College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Kudzu root wine, made by soaking kudzu root in 55% food-grade alcohol was treated by ultrasound before being allowed to stand for a certain time to accelerate the extraction of puerarin. Three process parameters including ultrasound power, treatment time and subsequent soaking time were optimized by response surface methodology to be 120 W, 12 min and 22 h, respectively. Under these conditions, the amount of puerarin extracted from kudzu root was 89.6 mg/g.

kudzu root; puerarin; kudzu root wine; ultrasonic; response surface methodology

TS252.54

A

1002-6630（2014）06-0001-05

10.7506/spkx1002-6630-201406001

2013-07-11

国家自然科学基金面上项目（31371807）；国家自然科 学基金青年科学基金项目（31201422）；

国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2011AA100903；2013BAD18B01-4）；国家农业科技成 果转化资金项目（2012GB23600639）；江苏省自然科学基金项目（BK2011651）；教育部博士点基金新教师类课题（20110097120028）；江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）

邱远（1990—），男，硕士，研究方向为中国传统食品与功能性物质。E-mail：quincy0213@gmail.com

*通信作者：董明盛（1961—），男，教授，博士，研究方向为食品微生物与生物技术。E-mail：dongms@njau.edu.cn