水通道蛋白在大鼠前列腺的表达及意义

裴利军，姜 睿，粟宏伟，邓青富，杨海帆，程 勇，朱永生

（泸州医学院附属医院泌尿外科，四川 泸州646000）

前列腺是男性重要的附属性腺器官，其发生、发育及分泌功能均受雄激素的调控［1，2］。前列腺液约占精液的20%～40%［3］，性腺机能减退及老年相关性男性不育与前列腺液的分泌减少及理化性质改变有关［4］。良性前列腺增生和前列腺癌等前列腺疾病的发生、发展均与雄激素关系密切。迄今为止，雄激素在生理和病理条件下对前列腺生长发育及分泌的调控机制仍未完全阐明。水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）是一个膜通道蛋白家族，可促进水和小分子物质的跨膜转运，广泛存在于人体各种组织器官，对于维持细胞内外水平衡及细胞分泌功能具有重要作用［5］。本文通过免疫组化和免疫印迹方法研究AQP1、3和4在大鼠前列腺的表达，以及雄激素对其表达的影响，探讨AQPs在前列腺中的功能，为研究前列腺疾病的发病机制提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 实验动物与分组及去势大鼠模型制备 健康雄性8周龄SD大鼠30只，体重280～300g，由泸州医学院实验动物中心提供，饲养环境温度20℃～25℃，12h光照，昼夜交替，正常饮食，自由饮水，适应性喂养1周后，随机分为3组：A组（对照组，n＝10）、B组（去势组，n＝10）、C组（去势＋睾酮替代组，n＝10）。1%戊巴比妥钠30mg／kg腹腔注射麻醉，取下腹正中切口，A组只切开腹腔，不切除睾丸，B组和C组均切除双侧睾丸。术后第二天开始，C组给予丙酸睾丸酮5mg／kg皮下注射，1次／d，对照组和去势组给予等量生理盐水注射，2周后尾静脉取血测定血睾酮浓度。

1．2 主要试剂与仪器 兔抗大鼠 AQP1、AQP3、AQP4多克隆抗体均购自美国Abcam公司，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG和BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，全蛋白提取试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司，DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，ECL化学发光液购自美国Millipore公司，丙酸睾丸酮购自美国Sigma公司。RM6280c型多通道生理信号采集处理系统为成都仪器厂生产，电泳槽和蛋白成像仪为美国Bio－Rad公司生产。

1．3 前列腺液的收集与标本制备 前列腺液的收集采用Knee RA［6］所描述的方法。1%戊巴比妥钠麻醉后，取下腹正中切口，显露前列腺后外侧盆神经，连接RM6280c型多通道生理信号采集处理系统电极，调整参数为波幅0．8ms、频率16Hz、电压8～12v，给予持续脉冲式电刺激，可见大鼠阴茎充血并缓慢勃起，直到前列腺液喷出。为避免尿液污染前列腺液，电刺激前先用注射器抽空膀胱内尿液。收集前列腺液并称重，切取腹侧前列腺，剔除周围结缔组织，称前列腺湿重并计算前列腺与体重比值，切除的标本－70℃保存。

1．4 免疫组化检测AQP1、3、4在大鼠前列腺的表达免疫组化采用SP法。4%多聚甲醛固定标本，常规石蜡包埋，4μm 连续切片，梯度酒精脱蜡至水，10mmol／L柠檬酸缓冲液（pH 6．0）微波修复抗原3min，室温冷却，PBS漂洗，滴加1%BSA，室温封闭2h，弃封闭液，滴加兔抗大鼠 AQP1（1∶100）、AQP3（1∶100）、AQP4（1∶100）抗体，置于湿盒内4℃过夜，PBS漂洗3次×5min，滴加0．3%H2O2，室温15min，封闭内源性过氧化物酶，PBS漂洗3次×5min，滴加辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，室温孵育15min，PBS漂洗3次×5min，DAB显色，光学显微镜下观察染色强度，苏木素复染，脱水、透明、封片。以PBS代替一抗作为阴性对照，光镜下观察棕黄色颗粒为阳性结果。

1．5 免疫印迹检测大鼠前列腺AQP1、3、4的表达标本剪碎液氮中研磨，加入预冷的组织裂解液（每1ml裂解液含磷酸酶抑制剂10μl，蛋白酶抑制剂5μl，100mmol／L PMSF 5？l），12000×g 4℃离心5min，取上清，BCA法测定蛋白浓度，加5×上样缓冲液，100℃沸水中变性5min，自然冷却。以40？g蛋白上样，12%SDS－PAGE分离蛋白，湿转法将蛋白转移到0．2μm孔径PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1h，加兔抗大鼠 AQP1（1∶1000）、AQP3（1∶1000）、AQP4（1∶2000）多克隆抗体孵育，4℃过夜，TBST洗膜3次×10min，加辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（1∶5000）室温孵育1h，TBST洗膜3次×10min，滴加ECL化学发光液，Bio－Rad蛋白成像仪显像。条带灰度值采用Quantity One4．6．2软件分析，以β－actin作为内参。

1．6 统计学分析 采用SPSS 13．0软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，组间均数比较采用单因素方差分析，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 各组大鼠生理指标比较 B组大鼠血睾酮水平［（13．07±1．83）nmol／L］较 A 组［（92．37±16．23）nmol／L］显著减低（P＜0．05），C组血睾酮［（88．09±13．24）nmol／L］与A组比较无统计学差异。B组前列腺液重量［（1．14±0．4）mg］较 A 组［（13．57±2．72）mg］显著降低（P＜0．05），C组前列腺液重量［（14．43±2．87）mg］与A组比较无显著差异。B组前列腺与体重比值（0．27±0．12）较 A 组（1．91±0．07）显著降低（P＜0．05），C组前列腺与体重比值（1．85±0．10）与A组比较无显著差异，见表1。

表1 各组生理指标比较（±s）Table 1 Comparison of physiological index in each group

表1 各组生理指标比较（±s）Table 1 Comparison of physiological index in each group

注：与A组比较，①P＜0．05

Group n Serum Level of testosterone（nmol／L）Weight of prostate fluid（mg）Ratio between prostate and body weight（mg／g×100%）A 10 92．37±16．23 13．57±2．72 1．91±0．07 B 10 13．07±1．83① 1．14±0．14① 0．27±0．12①C 10 88．09±13．24 14．43±2．87 1．85±0．10

2．2 AQP1、3和4在大鼠前列腺的表达定位 免疫组化结果显示，AQP1主要在大鼠前列腺间质的小动脉、小静脉壁表达，在前列腺腺泡上皮未见表达，见图1。AQP3主要在前列腺腺泡上皮细胞膜表达，见图2。AQP4则更多的在腺泡上皮靠近基底膜处表达，见图3。形态学观察可见B组前列腺的间质出现萎缩，腺上皮层变薄。

图1 AQP1在各组大鼠前列腺的表达（免疫组化×400）Figure 1 Expression of AQP1in prostate of each group （immunohistochemistry×400）

图2 AQP3在各组大鼠前列腺的表达（免疫组化×400）Figure 2 Expression of AQP3in prostate of each group（immunohistochemistry×400）

图3 AQP4在各组大鼠前列腺的表达（免疫组化×400）Figure 3 Expression of AQP4in prostate of each group（immunohistochemistry×400）

2．3 AQP1、3、4在大鼠前列腺的表达定量分析 免疫印迹结果显示，B组AQP1蛋白表达较A组显著降低（P＜0．05），C组与 A组比较无统计学差异，B组AQP3的表达较A组显著降低（P＜0．05），C组与A组无统计学差异，各组中AQP4的表达无明显变化（图4），蛋白表达的相对灰度值，见表2。

3 讨论

水的跨细胞膜转运是维持细胞赖以生存的内环境稳定的重要因素，近年研究显示，大量水的跨细胞膜转运依靠AQPs。迄今为止发现并成功克隆了13个水通道蛋白亚型，AQP0～12。其中AQP0、1、2、4、5、6和8对水具有通透性，AQP3、7、9和10对水和甘油具有通透性，AQP11和12具有与其它AQP亚型不同的原始结构［7～9］。AQPs广泛分布于人体多种组织器官中，特别是分泌功能旺盛的器官，在生理和多种病理情况下，AQPs均具有重要功能。据报道，在人类肾脏集合管上皮细胞AQP2表达较丰富，可促进肾小管对水的重吸收，在尿液浓缩过程中起重要作用［10］。AQP3基因敲除后的裸鼠，其皮肤表皮的水合作用明显减低［11］，AQPs可引起颅脑损伤后脑水肿的发 生［12］。Park［13］发 现 在 雌 性 大 鼠 的 阴 道 壁 存 在AQP1、2及3的表达，AQP1主要在阴道粘膜下层的毛细血管和小静脉壁表达，AQP2、3主要在阴道粘膜上皮细胞表达，大鼠性唤起时AQP1、2的表达由细胞器膜向细胞膜转移，表明AQP1、2在大鼠性唤起时可从阴道粘膜下小血管中转运大量液体到阴道，从而引起阴道润滑，并提出AQP2的表达受雌激素的调控。另有报道，高血糖可诱导雌性大鼠阴道壁中AQP1、2、3的低表达，是引起糖尿病大鼠阴道润滑下降的主要原因［14，15］。

表2 AQP1、3和4在各组前列腺的表达（与β－actin的相对灰度值，±s）Table 2 Expression of AQP1，3and 4in prostate of each group

表2 AQP1、3和4在各组前列腺的表达（与β－actin的相对灰度值，±s）Table 2 Expression of AQP1，3and 4in prostate of each group

注：与A组比较，①P＜0．05

Group n Relative greyvalue AQP1 AQP3 AP4 A 10 119．83±23．67 122．6±23．10 108．92±9．87 B 10 41．12±10．09① 71．8±10．08① 100．31±23．76 C 10 109．72±14．83 124．78±13．54 113．68±17．02

图4 免疫印迹检测AQP1、AQP3和AQP4在大鼠前列腺的表达Figure 4 Expression of AQP1，AQP3and AQP4in prostate of rats by Western Blotting

随着对AQPs研究的深入，发现在男性生殖道中有多种AQP亚型的表达，其表达部位和功能具有组织特异性。例如在人类输精管上皮细胞膜的刷状缘可见AQP1，2的表达。含有精子的睾丸液和附睾液从附睾管输出后，近50%～90%的液体成分在输精管中重吸收，从而使精子浓度急剧升高，推测AQP1、2参与了输精管液体重吸收过程中［16，17］。AQP1在小鼠输精管、精囊腺和前列腺中均有表达［18］，在人类精囊腺内皮细胞和前列腺毛细血管内皮细胞也可检测到AQP1的表达，但在附睾组织中未见表达，表明AQP1可能参与了精囊液和前列腺液的分泌［19］。Wang［20］等发现在人类前列腺腺泡基底膜及中间层细胞中AQP3大量表达，这也是具有分泌功能的柱状细胞含量最多的部位，而在间质细胞无表达，表明AQP3也可能参与前列腺分泌功能。AQP9在人和大鼠附睾输出管和输精管上皮细胞腔面细胞膜表达丰富，有利于对输精管内液体成分的重吸收，增加精子浓度，同时也表达在前列腺上皮细胞膜，参与前列腺液的分泌，但在精囊腺中无表达，雄激素可诱导AQP9在前列腺的高表达［21］。这些研究表明AQPs在男性生殖道及附属性腺中液体的重吸收和分泌具有重要作用。

4 结论

在大鼠前列腺中，AQP1、3和4均有表达，免疫组化显示AQP1主要在前列腺间质的小动脉和小静脉壁表达，而在具有分泌功能的前列腺腺泡上皮细胞未见表达，去势大鼠前列腺间质及上皮细胞出现不同程度萎缩，重量显著减少，免疫印迹检测AQP1表达显著降低，推测AQP1可能与前列腺细胞代谢和营养物质转运有关，对前列腺的生长发育，维持正常的结构具有重要作用。AQP3、4均在前列腺腺泡上皮丰富表达，但AQP3主要在上皮细胞膜表达，而AQP4更多地表达在靠近基底膜的腺上皮，AQP3、4可能均与前列腺分泌功能有关。去势大鼠前列腺液分泌显著减少，免疫印迹显示AQP3表达显著降低，而AQP4的表达未受影响，表明雄激素降低后前列腺液分泌减少与AQP3的表达降低有关，与AQP4无关。

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