CD47在单侧输尿管梗阻大鼠模型中调控血管生成的作用研究＊

夏梦迪，谢席胜，冯胜刚

（1．泸州医学院附属医院肾脏内科，四川 泸州646000；2．川北医学院第二临床医学院·南充市中心医院肾内科，四川 南充637000）

肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis，RIF）被认为是慢性肾脏病进展到终末期肾衰（end stage renal disease，ESRD）的共同通路和最主要病理改变之一。RIF主要表现为细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）在肾间质过度沉积、肾小管间质破坏和肾小管周围毛细血管（peritubular capillary，PTC）丢失［1］。其中，PTC的丧失与RIF的严重程度密切相关。TSP－1的常见受体CD47是一种整合素相关蛋白，分子量为40～55kDa。在RIF病变过程中TSP－1是否通过其受体CD47参与抑制血管生成，值得关注。本研究通过免疫组化检测TSP－1、CD47、VEGF在单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）模型中的表达，并初步研究这些细胞因子与PTC的关系，探讨TSP－1受体CD47在调控抑制血管生成的作用及机制。

1 材料和方法

1．1 试剂和仪器 3%戊巴比妥钠（由川北医学院动物中心提供）；TSP－1抗体（批号BA2130，购自博士德生物工程有限公司）；CD47（批号BS－2386R，购自博奥森生物技术有限公司）、VEGF（批号BA0407，购自博士德生物工程有限公司）、CD34（批号BA0532，购自博士德生物工程有限公司）。兔SP免疫组化染色试剂盒（北京中杉，批号SP－9001）；DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

1．2 实验动物和分组 清洁、健康SD大鼠75只，体重180～200g，购自川北医学院动物实验中心。将大鼠随机分为假手术组（SOR组）25只和模型组（UUO组）50只。UUO组随机分为5个时间点，分别为术后3天、7天、14天、21天和28天，每小组10只。SOR组按相同时间点随机分组，每组5只。

1．3 建立动物模型 术前使用5%水合氯醛，按6ml／kg腹腔注射麻醉大鼠。将大鼠按右侧卧位固定于手术台上，局部剃毛后，常规碘酒、75%酒精消毒，选择左侧腹切口，逐层切开，进入腹腔，分离左侧输尿管。用止血钳夹闭输尿管中段，并用4－0丝线于左侧输尿管两端，两次结扎其近肾盂段，剪断输尿管，连续缝合皮肤，即为UUO动物模型。SOR组只切开腹腔和游离左侧输尿管，不进行结扎和剪断。

1．4 病理检查 各组大鼠处死后取左肾组织，保存于10%多聚甲醛液中固定48h，石蜡包埋切片，经常规苏木精－伊红（HE）染色，观察肾组织病理学改变。根据文献描述方法，进行肾小管间质损伤半定量评分［2］和肾间质浸润炎细胞计数［3］。

1．5 免疫组化 采用SP法进行检测，观察肾脏TSP－1、CD47、VEGF的表达。以CD34代表PTC的表达。4μm石蜡切片，常规脱蜡下水，高压锅修复后滴加3%H2O2阻断内源性过氧化物酶。正常山羊血清37℃孵育封闭。加一抗4℃过夜。加入生物素标记山羊抗兔IgG 37℃孵育。加辣根酶标记链霉卵白素工作液37℃孵育。期间均用pH＝7．2的磷酸盐缓冲液反复冲洗。DAB显色，苏木素复染，梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。每次以PBS代替一抗作替代阴性对照。

采用Image Pro plus多媒体彩色病理图像分析软件进行分析。分别计算每例切片4个不重叠的400倍视野中，肾小管 TSP－1、CD47、VEGF、CD34阳性染色平均光密度值（integral optical density，IOD），取平均值，并做统计分析。

1．6 统计学处理 采用SPSS 13．0软件处理。资料采用¯x±s表示。组间差异选单因素方差分析，用SNK检验法进行组间两两比较。数据之间的关系采用Pearson相关分析。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 实验动物存活情况 UUO组大鼠1只术后麻醉过度未清醒，2只于术后一天死亡，对其解剖发现腹腔出血严重，死亡可能与伤及腹腔血管有关。另5只分别于术后第2、7、8、11、17天进食逐渐减少后相继死亡，剖开腹腔可见明显感染灶。SOR组1只大鼠术后未清醒，2只大鼠术后进食减少，分别在第4天和第10天死亡。共统计纳入大鼠64只（UUO组，n＝42；SOR组，n＝22）。

2．2 肾组织病理改变 HE染色显示，SOR组肾皮、髓质结构正常，肾小管间质及肾小球未见异常，无明显充血及炎细胞浸润。UUO术后3d可见肾小管明显扩张，空泡变性、炎症细胞浸润。UUO术后7d即可观察到明显的肾间质纤维化的表现如肾间质增宽、胶原沉积增加、肾小管萎缩等。术后14～21d，上述纤维化的征象更加明显。肾小管损伤程度评分显示，UUO各组较SOR组肾小管损伤评分随时间延长逐渐升高，结果见图1～3。

2．3 PTC（CD34）及VEGF的变化 免疫组化结果显示，SOR组：肾小球、肾小管结构均正常，CD34在肾小球毛细血管内皮细胞和肾小管上皮细胞中广泛表达，VEGF广泛存在于肾小管上皮细胞及细胞胞浆中；UUO 3天组：肾小管轻度扩张，肾小球、肾小管CD34表达减弱，VEGF表达也较前减少；UUO 7天组：肾小管扩张加剧，肾小管上皮细胞CD34、VEGF阳性表达进一步减少；UUO 14天组：肾小管扩张呈囊状，部分小管坏死，很少部分肾小管表达CD34，VEGF也只少量表达；UUO 21天组：肾小管减少，间质纤维化，残存肾小管表达少量CD34，少许肾小管上皮细胞表达VEGF；UUO 28天组：肾小球损伤轻微，肾小管减少，间质纤维化，CD34在肾小球毛细血管表达，肾小管CD34和VEGF的表达极少，结果见表1。

2．4 TSP－1、CD47的表达 免疫组化结果显示，SOR组：肾小管结构正常，无TSP－1表达，无CD47表达；UUO 3天组：肾小管肿胀，部分肾小管上皮细胞胞浆中TSP－1和CD47表达；UUO 7天组：肾小管扩张，部分空泡变性，大部分肾小管上皮细胞胞浆中TSP－1和CD47表达；UUO 14天组：肾小管扩张呈囊状，萎缩的肾小管上皮见TSP－1表达，部分坏死脱落到管腔的上皮细胞可见TSP－1阳性着色，萎缩的肾小管上皮有CD47表达，部分间质见CD47表达；UUO 21天组：肾小管减少，肾小管上皮细胞和纤维化明显的间质TSP－1表达，纤维化的间质CD47增加；UUO 24天组：肾小管减少，间质纤维化显著，TSP－1在纤维化显著的间质表达，CD47表达进一步增加，结果见表1。

图1 UUO大鼠肾组织病理改变（HE×100）Fig．1 Histological examination in rats with UUO（HE×100）

图2 炎细胞计数变化Fig．2 Change of inflammatory cell

图3 肾小管损伤评分Fig．3 Score of renal interstitial lesion

表1 各组大鼠肾小管免疫组化指标积分光密度（IOD，±s）Table1 Immunohistochemical level of IOD in rats with UUO

表1 各组大鼠肾小管免疫组化指标积分光密度（IOD，±s）Table1 Immunohistochemical level of IOD in rats with UUO

注：与假手术组相比：①P＜0．05，与 UUO 3天组相比：②P＜0．05；

组别 n CD34 Tsp－1 CD47 VEGF 22 12．00±1．94 0 0 86．19±13．22 UU O3天组 9 6．03±0．89① 6．96±2．24① 0．81±0．21① 56．62±5．34①UUO 7天组 9 4．24±0．53①② 11．95±1．99①② 1．39±0．19①② 41．08±3．30①②UUO 14天组 7 2．83±0．31①② 19．23±1．77①② 1．77±0．12①② 30．52±2．08①②UUO 21天组 8 1．80±0．33①② 27．51±3．78①② 2．40±0．25①② 21．66±2．64①②UUO 28天组 9 0．78±0．28①② 22．34±2．22①② 2．91±0．13①② 10．93±3．15 SOR组①②

2．5 相关性分析 相关分析显示CD47的表达与CD34的表达呈负相关（r＝－0．925，P＜0．01），与VEGF表达也呈负相关（r＝－0．946，P＜0．01），见图4。

图4 相关性分析Fig．4 Correlation analysis

3 讨论

UUO模型由于其造模简便，重复性高，可在短期内形成肾脏纤维化，是研究肾间质纤维化发病机制的理想模型。随着UUO时间的延长，病理切片显示肾小管出现了变性和坏死，间质炎性细胞浸润，且后期出现纤维化，然而肾小球损伤指标蛋白尿未出现明显差异，该结果与既往文献结果一致［4］。PTC病变与间质炎症以及随后纤维化的发生密切相关［5］。

肾脏毛细血管网的退化起因于内皮细胞丢失的增加以及损伤性的退化［6］。在这个过程中，具有促进血管生成的VEGF及具有抑制血管生成的TSP－1的地位一直倍受关注［7］。TSP－1的抗血管生成功能主要归因于3’N－末端I型凝血酶敏感蛋白重复序列（3TSR）和C－末端片段，分别通过两个主要受体CD36和CD47发挥抗血管的生成作用［8］。研究发现，CD36是角膜中TSP－1抑制血管生成所必需的［9］，但在血管细胞中TSP－1抑制血管生成需要的受体是CD47而不是CD36［10］。随着肾脏纤维化进程的进展，VEGF的表达逐渐下降，而TSP－1的表达却逐渐增强，这与文献报道一致［11］。TSP－1的受体CD47也在大鼠小管间质大量表达，且其表达模式与TSP－1一致。相关性分析证实，CD47积分光密度与CD34积分光密度及VEGF积分光密度均呈负相关。

4 结论

TSP－1与它的受体CD47结合，可能通过调控内皮细胞VEGF信号的传导，参与了UUO大鼠模型RIF过程中PTC病变的发生和发展。TSP－1与其受体CD47在RIF过程中PTC病变中的作用，值得进一步研究。

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