红景天苷纳米脂质体对亚急性辐射损伤小鼠的防护作用

夏书芹，范明辉，许时婴，张晓鸣，朱卫红，汪何雅

（江南大学食品学院，江南大学国家重点实验室，江苏无锡214122）

红景天苷纳米脂质体对亚急性辐射损伤小鼠的防护作用

夏书芹，范明辉，许时婴，张晓鸣，朱卫红，汪何雅

（江南大学食品学院，江南大学国家重点实验室，江苏无锡214122）

给小鼠饲以红景天苷（SE）及采用纳米脂质体包埋的红景天苷（SNL），用X射线进行全身性亚急性照射，检测外周血像、骨髓细胞DNA含量、肝脾组织中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）活力和外周血淋巴细胞转化等指标。结果表明，SNL较之于SE更能有效的保护小鼠血液系统，外周血各血象水平显著恢复，骨髓细胞DNA含量增加，外周血淋巴细胞凋亡被很大程度上抑制；免疫器官指数增加；对肝组织中MDA、SOD、GSH-Px的分析显示膜脂质过氧化水平降低，体系抗氧化能力增强。因此，红景天苷纳米脂质体对X射线亚急性辐射损伤有良好的防护作用。

红景天苷，纳米脂质体，辐射损伤

红景天苷（salidroside）是重要保健药源植物红景天的主要功能性成分，具有较好的抗辐射功能[1]。然而，很多相关药理学研究表明，水溶性的极性分子在胃肠道的吸收较差，体内的生物利用度低[2-3]。脂质体是水溶性和脂溶性成分的良好载体，能将活性成分包埋于脂质体双分子层及内水相中，在胃肠道可与粘膜细胞发生融合、胞饮、吞噬作用，促使活性成分进入胃肠道粘膜被吸收，具有靶向性、高效性、缓释性等优点。目前，国内外尚未见有关口服红景天苷纳米脂质体在动物体内功效方面的研究报道。本研究采用给口服红景天苷纳米脂质体的小鼠以X射线全身照射的方法，探讨了红景天苷纳米脂质体对小鼠亚急性辐射损伤的防护作用，旨在为抗辐射食品的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

ICR属清洁级小鼠 购自扬州大学动物医学中心，许可证号：SCXK（苏）2002-0009，体重22～25g，雌性；噻唑蓝（MTT） Sigma公司；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）试剂盒 南京建成生物研究所。

Epics XL流式细胞仪 美国贝克曼-库尔特公司；Multiska Mks酶标仪 Thermo electron公司。

1.2 红景天苷纳米脂质体的制备

采用乙醇注入法制备红景天苷纳米脂质体[4]。高山红景天苷部分纯化液中每10mL含红景天苷6.4mg，相当于1g生药量；红景天苷纳米脂质体中红景天苷载量为5%（w/w），磷脂浓度1%（w/w），即纳米脂质体中红景天苷的浓度为0.5mg/mL。

1.3 动物分组及处理

小鼠随机分成正常对照组、辐射对照组、阳性组，以及高、低剂量分别为5、1mL/kg的红景天苷纳米脂质体悬浮液剂量组（SNL），每组8只。辐射对照组给予生理盐水，阳性对照组给予红景天苷浓度为0.5mg/mL的提取液（SE），5mL/kg。各组经口灌胃1次/d，适应性喂养2d后，连续灌胃15d后进行X射线照射（正常对照组不照射，其余小鼠进行一次性全身照射），总吸收剂量为4Gy，能量6mV，剂量率300cGy/min，面积30cm×30cm，皮源距离100cm。照射后的小鼠分出一半用于外周血实验，另一半小鼠于照射后第3d处死，用于其他项目的检测。

1.4 检测指标和方法

1.4.1 外周血象的检测 于照射后第2、7、14、21、30d剪尾尖采血做白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血小板（Platelet，PLT）、血红蛋白（HB）的检测。

1.4.2 免疫脏器指数测定 照射后3d，小鼠断头取出各组织器官，称重，计算脏器指数。脏器指数以mg/10g体重表示。

1.4.3 肝和脾组织中SOD、MDA、GSH-Px的测定 照射后3d，取出肝和脾，用冷生理盐水制成10%（w/w）组织匀浆，按南京建成生物工程研究所的试剂盒说明书进行SOD、MDA和GSH-Px测定。

1.4.4 骨髓细胞DNA测定 参考文献[5]方法分析骨髓DNA含量：取一侧股骨，除尽软组织，用10mL CaCl2将其冲入离心管中，4℃、2500r/min离心30min，弃去上清液，加入5mL HClO4，将沉淀充分混合后，95℃加热15min，冷却，滤纸过滤，滤液于268nm测定吸光值，计算得到每根股骨所含DNA（μg）。

1.4.5 外周血淋巴细胞转化 参考文献[6]方法采用MTT法。将小鼠摘眼球取血于抗凝管中，加入等量的D-Hank’s液稀释后，用红细胞裂解液分离淋巴细胞。淋巴细胞于离心管中，用D-Hank’s洗涤两遍，离心弃上清，加入适量RPMI1640培养液，调整细胞悬液浓度为2×106个/mL将细胞悬液接种于96孔培养板中，100μL/孔，每个样品设3个平行孔，每孔加入7.5μL ConA，37℃、5%CO2、饱和湿度下培养48h。采用MTT法检测ConA诱导的外周血淋巴细胞转化活力，加MTT（5mg/mL）10μL/孔，继续培养4h，加入二甲亚砜100μL/孔，酶标仪上590nm处测定吸光值。

淋巴细胞转化活力用刺激指数SI表示：

1.4.6 外周血淋巴细胞凋亡 小鼠眼球取血于抗凝管中，加入等量的D-Hank’s液稀释后，用红细胞裂解液分离淋巴细胞。小心吸取悬浮的淋巴细胞于离心管中，用D-Hank’s洗涤两遍，1000r/min离心5min，弃上清液。PBS重悬后，1000r/min离心5min，弃去PBS。加入PI染料染色，4℃避光染色30min。采用流式细胞仪检测。流式细胞仪参数：氢离子激发荧光，激发波长488nm，发射波长大于630nm，产生红色荧光，仪器自带软件分析PI荧光强度的直方图和前散色光对侧散色光的散点图。结果评定：以直方图（横坐标为DNA相对含量，纵坐标为细胞数）表示测定结果，低于G1期细胞DNA含量的峰为凋亡细胞群体峰。

1.5 数据处理

数据以x±SD表示，采用Origin统计软件进行分析，组间差异比较采用One-Way ANOVA检验或检验。

2 结果与分析

2.1 外周血象的影响

血液系统对辐射甚为敏感，一定剂量射线作用后，可引起不同程度的外周血象的变化。对辐射小鼠造血功能的研究结果表明（图1），辐射对照组在辐射后2d内血液中白细胞数（WBC）急剧下降（p＜0.01），WBC在辐射后第2d降至最低水平，至辐射后21d仍未恢复到正常水平，仅为正常水平的76%，表明辐射对WBC的杀伤能力很强。SE阳性对照组和SNL高剂量组在辐射后第2d，WBC虽然也明显下降，但降低的幅度大大低于辐射对照组（p＜0.01），分别为辐射对照组的1.5倍和2倍。至辐射后21d，SE阳性对照组和SNL高剂量组WBC基本可以恢复到正常水平。

辐射后2d内红细胞（RBC）的数目明显降低，辐射后7d内血小板（PLT）和血红蛋白（HB）的数目也呈明显下降趋势，并均在第7d降至最低。SE阳性对照组和SNL剂量组的各项指标的下降趋势则明显地慢于辐射对照组，结果差异显著（p＜0.01）。辐射一周之后，各项指标逐渐回升。与辐射对照组相比，SNL 5mg/kg剂量组效果最为明显，到第21d基本与正常对照组水平，接近甚至超过辐射前血象水平。与同剂量SE阳性对照组比较，SNL对造血功能的恢复效果更明显，结果差异显著（p＜0.05）。表明SNL相对于SE能显著的改善小鼠造血系统的辐射损伤。

2.2 免疫脏器指数的影响

辐射所致的免疫功能改变是辐射损伤的主要表现之一。胸腺和脾脏是机体参与免疫功能调节的重要免疫器官，是高辐射敏感的细胞群。一般情况下，机体受辐射后其脾脏系数、胸腺系数都会下降，机体免疫功能降低。表1结果显示，SE和SNL组与辐射对照组的脾脏指数和胸腺指数比较差异显著（p＜0.05）。这表明动物辐射模型建立成功。SNL 5mg/kg剂量组的结果和SE阳性对照组比较，两组免疫脏器指数均有所提高，而且差异显著（p＜0.05）。

2.3 肝和脾组织中SOD、MDA、GSH-Px的影响

电离辐射是一种非特异性的物理刺激因子，射线产生的羟自由基作用于生物膜脂质双层中的不饱和脂肪酸，使体内发生脂质过氧化反应，产生大量脂质过氧化物MDA，引起体内酶或其他与清除自由基相关物质的变化，破坏了体内自由基产生与清除的平衡，导致机体抗氧化能力下降，从而出现不同程度的辐射损伤[7]。机体中参与并清除自由基与防止脂质过氧化反应的主要酶类有SOD、GSH-Px等，通过检测机体中此类酶系的活力和MDA的累积含量可反映出受辐射损伤的程度。

由表2、表3可知，辐射可使肝脏和脾脏组织中MDA含量明显上升（p＜0.05），使SOD、GSH-Px活力下降（p＜0.05）。SNL可抑制组织中MDA升高幅度，降低SOD、GSH-Px活力下降幅度，与辐射对照组相比均有显著性差异（p＜0.05），并接近正常对照组水平。较之SE 5mg/kg阳性对照组，SNL 5mg/kg剂量组对MDA含量的上升和对SOD、GSH-Px活力下降幅度的抑制作用更强。

表2 红景天苷纳米脂质体对肝脏中MDA、SOD、GSH-Px的影响Table.2 Effect of salidroside nanoliposomes on MDA content，SOD and GSH-Px activity in the livers

表3 红景天苷纳米脂质体对脾脏中MDA、SOD、GSH-Px的影响Table.3 Effect of salidroside nanoliposomes on MDA content，SOD and GSH-Px activity in the spleens

2.4 骨髓细胞DNA的影响

细胞中DNA是辐射损伤的一个重要的靶分子，放射生物学效应很多是通过DNA损伤表现出来的。DNA不但是辐射直接作用的靶点，也是辐射所产生的自由基间接攻击的目标之一，最终引起DNA断裂、基因突变、染色体重组、细胞转化和细胞死亡等[8]。

图2 红景天苷纳米脂质体对辐射小鼠骨髓细胞DNA含量的影响Fig.2 Effect of salidroside nano-liposomes on DNA content in the medulla of radiated mice

由图2可知，X射线辐射后，小鼠骨髓DNA的含量均要低于正常对照组（p＜0.01）。与辐射对照组比较，各剂量组显著增加辐射小鼠骨髓DNA含量（p＜0.01）。SNL 5mg/kg剂量组对骨髓DNA含量增加远大于SE 5mg/kg剂量组（p＜0.05）。表明SNL能够更有效地降低X射线辐射对小鼠DNA造成的损伤。

2.5 外周血淋巴细胞转化的影响

淋巴细胞分裂旺盛，新生与衰老细胞数大致相等，属更新类组织细胞，是对辐射最为敏感的细胞群体。淋巴细胞在丝裂原的刺激下，可以转化为淋巴母细胞，从而淋巴细胞的增殖能力增强，具有更强的免疫活性。淋巴细胞转化实验是检测机体免疫状态的一种常用方法，对刺激的应答能力是淋巴细胞功能状态及成熟程度的重要指标之一[9]。

与辐射对照组相比，SNL各剂量组小鼠淋巴细胞刺激指数差异具有显著性（p＜0.05）。SNL 5mg/kg剂量组的淋巴细胞刺激指数与SE 5mg/kg阳性对照组比较差异显著（p＜0.05）。图3结果表明，SNL较SE能够更好地减轻辐射对机体免疫功能的损伤。

图3 红景天苷纳米脂质体对辐射小鼠外周血淋巴细胞转化的影响Fig.3 Effect of salidroside nanoliposomes on SI of lymphocyte in periphery blood of radiated mice

2.6 外周血淋巴细胞凋亡的影响

由表4可知，辐射对照组经过X射线的照射后外周血淋巴细胞明显发生凋亡。与正常对照组相比，辐射组凋亡率增加了9.6倍，这表明了X射线引起了细胞的损伤，导致细胞凋亡。灌胃红景天苷提取液和红景天苷纳米脂质体可以大大降低细胞的凋亡率，从结果可知，SE 5mg/kg阳性对照组能够将凋亡率降至2.5%，比辐射对照组下降了2.5倍（p＜0.05）。SNL 1mg/kg剂量组也能够将凋亡率降低至3.02%，远远低于辐射对照组（p＜0.05）。与SE 5mg/kg阳性对照组比较，SNL 5mg/kg剂量组的凋亡率低了一倍多，差异显著性统计学有意义（p＜0.05）。表明SNL可有效的提高红景天苷对X射线引起的淋巴细胞凋亡的抑制作用。

表4 红景天苷纳米脂质体对辐射小鼠外周血淋巴细胞凋亡的影响Table.4 Effect of salidroside nanoliposomes on apoptosis of lymphocyte in periphery blood

3 结论

红景天苷纳米脂质体较红景天苷溶液有较强的辐射防护能力，保护小鼠血液系统，外周血各血象水平显著恢复，骨髓细胞DNA含量增加，外周血淋巴细胞刺激指数大大提高，外周血淋巴细胞凋亡被很大程度上抑制；巨噬细胞吞噬能力增强，免疫器官指数增加；对肝组织中MDA、SOD、GSH-Px的分析显示膜脂质过氧化水平降低，体系抗氧化能力增强。因此SNL对小鼠亚急性辐射损伤具有良好的防护作用。

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Protective effect of salidroside nano-liposomes against sub-acute radiation damage

XIA Shu-qin，FANG Ming-hui，XU Shi-ying，ZHANG Xiao-ming，ZHU Wei-hong，WANG He-ya
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Salidroside and salidroside-loaded nanoliposomes were administered to mice，and then the mice were exposed to X-ray.Indices including periphery blood cell，DNA content in the medulla，MDA content，SOD and GSH-Px activity in the livers and spleens，lymphocyte transformation of periphery blood were measured. The blood system in the SLN-treated groups was protected better than that of SN-treated groups.Cell level of periphery blood was significantly resumed.DNA content in the medulla increased，and apoptosis of lymphocyte in periphery blood was inhibited to a great extent.Furthermore，spleen index and thymus index were enhanced. Results of MDA content，SOD and GSH-Px activity in the livers and spleens showed that peroxidation level of membrane lipids decreased and antioxidative capacity increased in SLN-treated groups.Therefore，SLN had a significant protective effect against sub-acute radiation damage.

salidroside；liposomes；radio damage

TS201.4

A

1002-0306（2014）06-0334-04

2013－05－07

夏书芹（1979-），女，博士，副教授，主要从事功能性食品配料与添加剂方面的研究。

国家自然科学基金青年基金（NSFC31000815）；国家十二五科技支撑计划（2012BAD33B05）；江苏高校优势学科建设工程资助项目。