陕西平利绞股蓝氨基酸类成分指纹图谱研究

陈培云，贡东军，赵志磊，庞艳苹

（河北大学质量技术监督学院，河北保定071002）

陕西平利绞股蓝氨基酸类成分指纹图谱研究

陈培云，贡东军，赵志磊，庞艳苹

（河北大学质量技术监督学院，河北保定071002）

采用柱前衍生高效液相色谱（HPLC）技术对陕西平利绞股蓝中氨基酸类成分的指纹图谱进行研究。结果表明，以邻苯二甲醛为柱前衍生试剂，Kromasil C18分离，流动相为0.05mol/L醋酸钠+0.5%四氢呋喃-甲醇，采用梯度洗脱，绞股蓝中氨基酸类成分可得到良好的分离，同时对样品中16种氨基酸的含量进行定量；通过对13批样品HPLC图谱的分析，共确定22个色谱峰作为平利绞股蓝的特征指纹峰，利用夹角余弦法、相关系数法、中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件进行相似度计算，13批陕西平利绞股蓝指纹图谱相似度0.989～1.00之间，该图谱能综合、准确地反映陕西平利绞股蓝氨基酸类成分的特征，为保护平利绞股蓝原产地域产品提供了新的途径。

绞股蓝，氨基酸，指纹图谱，陕西平利，高效液相色谱法

绞股蓝又名七叶参，素称南方人参，系葫芦科多年生草质藤本植物，绞股蓝味苦、性寒。具有抑制肿瘤、降低血脂、清热解毒、止咳酄痰等作用[1]。地处北亚热带湿润季风气候区的平利县，由于雨量充沛，气候温和，日照充足，无霜期时间长，土壤有害物质含量低，成为中国国内生态型药用植物种植示范基地的最佳区域[2]。近年来随着陕西平利绞股蓝的名气提升，价格也随之提高，一些不法商贩为了获得利益，经常将其他产地的绞股蓝冒充原产地产品。而目前对于绞股蓝品质的鉴别还主要依靠感官审评的方法，导致的主观性及不稳定性，缺乏量化依据。指纹图谱是随着现代分析技术发展而诞生的一种从整体上研究复杂物质体系的技术，是以各种光谱、波谱、色谱等技术为依托的又一种质量控制模式[3]。通常得到的指纹图谱相当复杂，人工比较难免影响结果的准确性。若将其与计算机图谱解析和识别技术结合起来，其应用前景将大为扩展[4-5]，利用色谱指纹图谱技术在绞股蓝研究中的应用目前已有报道。主要集中于黄酮类的研究，对于绞股蓝氨基酸的研究报道甚少。本文根据陕西平利地区绞股蓝特有的特点，结合原产地保护及品质控制需求，通过柱前衍生高效液相色谱法建立平利绞股蓝氨基酸指纹图谱，采用计算机数据处理软件综合运用相关系数、夹角余弦、中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件进行相似度分析，对陕西平利的绞股蓝氨基酸类成分指纹图谱方法进行了探索研究，以期为陕西平利绞股蓝的鉴别和质量控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

邻苯二甲醛 分析纯，上海源叶生物科技有限公司；β-巯基乙醇（amresco，分析纯）、甲醇（色谱纯）天津市科密欧化学试剂有限公司；四氢呋喃 分析纯，上海同试化工有限公司；乙酸钠 优级纯，天津市光复精细化工厂；硼酸 ≥99.8%，天津市凯通化学试剂有限公司；氢氧化钠 ≥98%优级纯，天津市北联精细化学品开发有限公司；氨基酸对照品：天冬氨酸（20121123）、蛋氨酸（20110415）、赖氨酸（20130113） 购自上海源叶生物科技有限公司；谷氨酸（14690-201203）、丝氨酸（14688-201001）、组氨酸（140693-201102）、甘氨酸（140689-201103）、苏氨酸（140682-201102）、丙氨酸（140680-201002）、色氨酸（140686-201002）、缬氨酸（14681-201202）、苯丙氨酸（140676-201106）、异亮氨酸（140683-201202）、亮氨酸（140687-201102） 购自中国食品药品检定研究所；精氨酸（≥99.2%）、酪氨酸（≥99.4%） 购自中国计量科学研究院；实验用水 为Milli-Q超纯水，流动相以0.45μm的滤膜过滤；绞股蓝样品 购自陕西平利县兴强富硒茶业有限公司，共计购得2012年间出厂的规格为500g/包的绞股蓝样品50包，从中随机抽取13包作为实验用材。

Agilent1100高效液相色谱仪 Agilent色谱工作站，色谱柱Kromasil C18，5μm，4.6mm×250mm，检测器为Agilent G1321荧光检测器，美国安捷伦科技公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；高速中药粉碎机 武义县屹立工具有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 氨基酸标准溶液制备 分别精密称取16种标准氨基酸各0.25g于25mL容量瓶中，加超纯水溶解并定容后备用。

1.2.2 供试样品制备 绞股蓝在50～60℃下烘干干燥，干燥后的材料用植物粉碎机粉碎并过80目筛，准确称取绞股蓝0.6g，置于100mL容量瓶中，用二次去离子水至近刻度，30℃超声提取30min（100kHz，80W），冷却后，二次去离子水定容至刻度，10000r/min离心弃去沉淀，离心液用0.45μm滤膜过滤，备用。

1.2.3 衍生及分析 衍生试剂的配制：称取0.27g邻苯二甲醛（OPA）溶于5mL无水乙醇中，加入100μL 2-巯基乙醇，用0.4mol/L的硼酸（pH=9.5，氢氧化钠溶液调制）定容到50mL，混匀，置于暗处，每隔1d补加10μL巯基乙醇，每周需重新配制。

移取100μL标准溶液或样品于2mL的棕色样品瓶中加入等量的OPA衍生化试剂，在混匀器中混匀，反应1.5min，取50μL（定量环为20μL）注入高效液相色谱仪，按下述色谱条件操作，记录30min色谱图。

1.2.4 色谱条件 色谱柱为Kromasil C18（4.6mm× 250mm，5μm），流动相（A）：0.05mol/L醋酸钠+0.5%四氢呋喃；流动相B：甲醇。梯度洗脱线性梯度：（T，B%）（0min，20%）（27min，88%）（34min，20%）。流速为1.0mL/min，柱温为35℃，荧光检测激发波长为340nm，发射波长为460nm，进样量为20μL。每次样品完成后，系统平衡10min。

1.2.5 方法的稳定性及精密度 取样品按上述方法分别在0、2、4、8、10、12、24h衍生进样，研究方法的稳定性；取同一样品5份，分别进样，研究方法的重复性；取1份样品，连续6次进样，研究方法的精密度。

1.2.6 方法的准确度 从同一来源的绞股蓝样品中取10份样品，每份0.6g，其中9份平均分为3组，每组样品分别加0.0096、0.064、0.16μg·mL-1的混合标准溶液；剩余的1份样品中加入与混合标准溶液等体积的水作为对照；按所建立的方法对样品进行处理及测定，考察16种氨基酸的加标回收率。

1.2.7 数据处理 实验通过对样品的制备、经高效液相色谱分析后，对所有的数据采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件以及SPSS数据处理软件进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 HPLC测定氨基酸方法的建立及分析

2.1.1 供试品溶液的制备 比较了纯水提取以及水提后乙酸锌沉蛋白的方法提取绞股蓝中游离氨基酸成分，实验发现水提乙酸锌沉蛋白的方法氨基酸的回收率过低，采用纯水进行浸泡、超声、离心提取，操作较为简单且出峰最稳定，故选择纯水提取处理后直接衍生，并未对提取液进行其他除杂处理。

2.1.2 衍生条件的优化 实验中发现衍生时间对氨基酸的峰面积有很大的影响。衍生时间太短，反应不完全，衍生时间太长，氨基酸与衍生剂形成的化合物极易降解，因此在建立药材指纹图谱时必须严格控制反应时间在1.5～2min之间。

2.1.3 HPLC色谱条件的优化 本文在前人的研究基础上优化改进了色谱条件，使得16种氨基酸能在35min中内完成，分离效果较好，详见表1中的HPLC色谱洗脱梯度。

表1HPLC色谱洗脱梯度Table.1 The gradient elution for HPLC

2.2 方法学验证

2.2.1 方法的专属性 在上述色谱条件下进样分析，空白衍生试剂、标准溶液、样品色谱图见图1～图3，由图可见氨基酸在26min内基本达到了完全分离，内源性物质及衍生化试剂不干扰氨基酸的测定。方法具有较好的专属性。

2.2.2 精密度实验 精密度实验结果表明，各主要色谱峰的相对丙氨酸参照峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.10%～0.32%、0.28%～3.3%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 重复性实验 精密称取同一绞股蓝5份，分别进样，结果各主要色谱峰相对丙氨酸参照峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别0.2%～1.5%、0.26% ～3.5%，表明本方法重复性好。

图1 空白衍生试剂色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of derivatization reagent

图2 16种氨基酸对照品色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of 16 amino acids compounds standards

图3 绞股蓝水提取液色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of Gynostemma pentaphylla

2.2.4 稳定性实验 精密吸取同一绞股蓝供试品溶液，分别在0、2、4、8、10、12、24h衍生进样，记录色谱图。结果各主要色谱峰相对丙氨酸参照峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.58%～2.65%、0.69% ～2.39%，表明供试品溶液在24h内稳定，稳定性良好。

2.3 线性分析

分别精密吸取不同浓度的混合标准品溶液，经柱前衍生化后，分别进样分析，以氨基酸溶液浓度（x）为横坐标、以色谱峰面积（y）为纵坐标绘制氨基酸的标准工作曲线，线性范围为0.0032～8mg·L-1，16种氨基酸标准的线性方程及相关系数见表2。结果表明16种氨基酸在所测浓度范围内进样浓度和峰面积具有良好的线性关系。

表2 线性实验结果Table.2 The results of linear relation

2.4 加标回收率

从同一来源的绞股蓝样品中取10份样品，每份0.6g，其中9份平均分为3组，每组样品分别加0.0096、0.064、0.16μg·mL-1的混合标准溶液；剩余的1份样品中加入与混合标准溶液等体积的水作为对照；按所建立的方法对样品进行处理及测定，考察16种氨基酸的加标回收率，结果见表3。由表3可见，在上述3个加标水平下，16种氨基酸的回收率在75.9%～96.6%之间，相对标准偏差（RSD）在1.72%～8.96%之间。可见该方法具有较高的回收率和较好的精密度，可以满足绞股蓝样品中检测中16种氨基酸含量的需要。

2．5 13批绞股蓝样品中16种氨基酸含量的测定

应用建立的方法，对13批平利绞股蓝样品中的游离氨基酸含量进行了测定，各氨基酸含量见表4。由表4可以看出，13批平利绞股蓝中富含多种氨基酸，其中天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、精氨酸4种氨基酸的含量较其他氨基酸要高，16种氨基酸的含量各不相同。

2.6 平利绞股蓝氨基酸指纹图谱的建立

将13批平利绞股蓝药材按2.1.1制备供试品溶液，按2.1.2方法进行衍生及测定，记录色谱图。通过化学工作站按表1进行积分后，将13批次测得图谱导入相使用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004A版），设定时间窗0.5，选择保留时间为6.069的谷氨酸色谱峰和保留时间为14.79的丙氨酸色谱峰为校正峰，对13个样品的色谱峰进行匹配并自动生成对照指纹图谱，见图4。确定指纹图谱中有22个特征共有峰，在22个共有峰中，15号峰（丙氨酸），分离度好，因此为内参峰。计算13批样品峰的相对峰面积，结果见表5，13批药材的指纹图谱见图5。

2.7 13批样品指纹图谱相似度评价

为了更好的体现共有特征，建立准确稳定的指

纹图谱，分别采用相关系数，夹角余弦及中国药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004A版）对13批样品HPLC图谱进行综合评价，其中相关系数，夹角余弦以13批样品相对面积中位数为共模，相似度评价软件13批样品峰面积中位数为对照，以S1样品为参照进行相似度计算。相似度计算结果见表6。

表3 16种氨基酸的三个添加水平的加标回收率（%）Table.3 The recovery of standard addition 16 amino acids compounds from three levels（%）

表4 13批绞股蓝样品中16种氨基酸检测结果Table.4 The result of 16 amino acids compounds in 13 Gynostemma pentaphylla samples

图4 平利绞股蓝药材对照指纹图谱（共有模式）Fig.4 Representative HPLC fingerprints of pingli Gynostemma pentaphylla（common module）

图5 平利绞股蓝药材13批次样品指纹图谱Fig.5 HPLC fingerprint chromatogram for thirteen batches of samples

表5 13批平利绞股蓝共有峰相对峰面积Table.5 The relative peak area of common peaks for thirteen batches of pingli Gynostemma pentaphylla

从13批次样品HPLC指纹图谱来看，13批绞股蓝氨基酸指纹图谱中主要有22个特征共有峰，绞股蓝药材各色谱峰经与氨基酸对照峰比较，已确定绞股蓝的指纹图谱中22个共有峰中的1、2、7、8、9、10、11、14、15、17、18、19、20、21分别为天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、酪氨酸、丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸。同时发现13批样品的指纹图谱中主要峰群的整体图貌基本一致；指纹图谱采用多种相似度指标验证不同批次样品之间的相似程度，其中相关系数、夹角余弦是特征变量上变化模式的相似性，可反应各峰比例相似性，本实验13批样品指纹图谱均达到0.992以上；用相似度评价软件计算的相似度均大于0.98，说明样品指纹图谱在构型上极为相似，实验中多种指标相似度结果具有一致性。

表6 不同相似度指标验证13批平利绞股蓝之间的相似程度Table.6 Differentm ethods validatesim ilarity of thirteen batches of pingli Gynostemma pentaphylla

3 结论

色谱指纹图谱分析是对中药及其制剂进行综合宏观分析的可行手段之一。本文建立了柱前衍生高效液相色谱－荧光检测法测定绞股蓝中16种氨基酸的方法。采用所建立的方法，测定了陕西平利绞股蓝的含量，同时考查了陕西平利绞股蓝中氨基酸类成分指纹图谱，结果表明由13个批次的陕西平利绞股蓝药材构建的氨基酸指纹图谱具有较强的特征性，利用夹角余弦法、相关系数法、中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件进行相似度计算，测得13批陕西平利绞股蓝指纹图谱相似度0.989～1.00之间，说明本方法稳定，可靠，重复性好。

通过本次实验可以为初步建立陕西平利绞股蓝指纹图谱奠定基础，为下一步建立完整的陕西平利绞股蓝指纹图谱体系提供方法依据。要建立陕西平利绞股蓝指纹图谱，必须要有覆盖全、采摘加工时间和工艺一致、足够的样本量以及稳定的方法体系。通过此次方法探究，可以确定采用高效液相色谱法建立陕西平利绞股蓝指纹图谱体系是可行的，但同时要有覆盖面全且信息足够的样本。指纹图谱的建立可以减少平利绞股蓝品质审评因感官审评带来的主观性和不确定性，可为其质量的全面控制提供参考，并为保护平利绞股蓝原产地域产品提供新的方法。

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Study on HPLC fingerprints of amino acids constituents of Gynostemma pentaphylla cultivated pingli Shaanxi

CHEN Pei-yun，GONG Dong-jun，ZHAO Zhi-lei，PANG Yan-ping
（College of Quality&Technical Supervision，Hebei University，Baoding 071002，China）

Using high performance liquid chromatography（HPLC）with Pre-column Derivation technology to study the fingerpingt chromatogram of amino acids compounds of Gynostemma pentaphylla cultivated pingli Shaanxi.Results showed that the main amino acids compounds of Gynostemma could be separated well and determined with O-phthalaldehyde as the derivatization reagent，Kromasil C18column as the chromatographic column，0.05mol/L sodium acetate with 0.5%furanidineand and methanol as the mobile phase，by the gradient elution method.13 samples of HPLC fingerprints showed that this method could identify a total of 22 chromatographic peaks as Gynostemma pentaphylla cultivated pingli Shaanxi fingerprint peaks.The similarities were determined by the coefficients of cosine，correlation and Similarity evaluation system for chromatographic fingerprint（Version 2004 A）.Results of similarity analysis were 0.989～1.00.It could generally and exactly reflect the characteristics amino acids compounds from pingli Shaanxi.The developed method provided a new method for protecting Gynostemma pentaphylla cultivated pingli source territory.

Gynostemma pentaphylla；amino acids compounds；fingerprints；Shaanxi pingli；HPLC

TS201.2

A

1002-0306（2014）06-0067-06

2013－08－05

陈培云（1973-），女，博士，主要从事食品分析检测方面的研究。

质检公益性行业科研专项项目（201210010-4）。