PEG/Na2SO4双水相萃取木瓜蛋白酶的研究

PEG/Na2SO4双水相萃取木瓜蛋白酶的研究

王伟涛，张海德*，蒋志国，董安华，许英豪，彭 健，王 斐
（海南大学食品学院，海南海口570228）

采用聚乙二醇（PEG）/硫酸钠（Na2SO4）双水相体系对木瓜蛋白酶进行分离提取。考察各成相试剂及pH对木瓜蛋白酶活性的影响，研究体系中不同相对分子量PEG、硫酸钠和PEG的质量分数、pH、酶添加量等因素对木瓜蛋白酶在两相体系中分配行为的影响，采用响应面法优化双水相萃取木瓜蛋白酶的最佳分离条件，并进行了实验室规模的放大。结果表明：Na2SO4的质量分数对分配行为的影响极显著，其次是PEG的质量分数，pH对分配行为的影响不显著。当两相体系中PEG的相对分子量为6000，质量分数为16.0%、Na2SO4质量分数为18.0%、pH7.0、酶添加量为1.0mg/g时，木瓜蛋白酶在两相体系中的分配系数最高可达3.1，可获得木瓜蛋白酶活性回收率82.6%。实验证明：响应面法优化双水相萃取木瓜蛋白酶的条件是可行的，可用于实际预测。

木瓜蛋白酶，双水相，分配系数，酶活性回收率

木瓜蛋白酶（EC3.4.22.2）具有耐高温、稳定性好、蛋白质水解能力强等特征，在食品、医药等领域有广泛的应用。目前木瓜蛋白酶的分离纯化方法主要有：超滤法、盐析法、有机溶剂法、亲和层析法等。但这些纯化木瓜蛋白酶的方法都存在一些问题[1]，有必要寻找制备高纯度高活性木瓜蛋白酶的新方法。双水相萃取是分离和纯化酶及蛋白质等生物活性物质的一种新方法，具有条件温和、产品活性损失小、处理量大、分离步骤少、无有机溶剂残留、设备投资小、操作简单、易于工程放大和连续操作等优点，非常适合大规模应用[2]。而对木瓜蛋白酶双水相萃取的研究主要集中在PEG/（NH4）2SO4和PEG/磷酸盐双水相系统[1]，PEG/Na2SO4双水相萃取木瓜蛋白酶的研究报道甚少。

本实验拟采用聚乙二醇（PEG）/硫酸钠（Na2SO4）双水相体系，考察聚乙二醇相对分子量，PEG和硫酸钠质量分数、pH、酶添加量等因素对木瓜蛋白酶在两相体系中分配行为的影响，并采用响应曲面法优化了木瓜蛋白酶萃取条件，为大力推动木瓜蛋白酶工业化高效制备的发展提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

木瓜蛋白酶（BR） 生物生工有限公司；PEG2000（化学纯）、PEG4000（化学纯）、PEG6000（化学纯）、G-250 国药集团化学试剂有限公司；硫酸钠（分析纯） 广州化学试剂厂；其他 均为市售分析纯。

TU1901型紫外可见分光光度计 北京普析通用有限责任公司；DK-98-1型恒温水浴锅 天津泰斯特仪器有限公司；PHS-3C型pH计 上海雷磁仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 木瓜蛋白酶活性的测定 以酪蛋白为底物，测定木瓜蛋白酶的活性[3]。

1.2.2 蛋白质含量的测定 采用考马斯亮蓝法测双水相中蛋白质的含量[4]。

1.2.3 双水相萃取木瓜蛋白酶 配制一定质量分数的PEG和Na2SO4原溶液，构造不同的双水相体系，加入计算好的PEG和Na2SO4原溶液以及木瓜蛋白酶溶液（10.0mg/m L），然后加去离子水至20.0g，常温振荡30.0min，然后静置至分相。读取上下相体积，按1.2.2测上下相的蛋白质浓度P（mg/m L），按1.2.1测上相的酶活性浓度E（U/m L），计算相比R、分配系数K和酶活性回收率Y（%）。计算式为：

R=Vtop/Vbot

式中，Vtop—上相体积（m L）；Vbot—下相体积（m L）。

式中，Ptop—上相蛋白浓度（mg/m L），Pbot—下相蛋白浓度（mg/m l）。

Y（%）=Etop×Vtop/Me×100

式中，Etop—上相酶活性浓度（U/m L）；Me—加入系统酶的总活性（U）。

1.3 单因素实验

1.3.1 不同pH的酶活性 常温下配制不同pH的酶溶液，按1.2.1测酶活性。

1.3.2 各成相试剂对木瓜蛋白酶活性的影响 配制质量分数为5.0%、10.0%、15.0%、20.0%、25.0%、30.0%的PEG（2000，4000，6000），硫酸钠溶液，各取2.0m L分别加入1.0m L稀释一定倍数的酶溶液，放置10.0min后测酶活性。空白取2.0m L去离子水加1.0m L相同稀释倍数的酶溶液。以酶活活性比X为指标，考察各成相试剂对酶活性的影响。

X（%）=成相物质存在时的酶活/空白试剂的酶活×100

1.3.3 不同相对分子量PEG对分配行为的影响 固定PEG质量分数16.0%，Na2SO4质量分数16.0%，pH 7.0，酶添加量1.0mg/g（酶的质量/系统的总质量，以下同），考察不同PEG相对分子量对分配行为的影响。

1.3.4 不同Na2SO4质量分数对分配行为的影响 固定PEG质量分数为16.0%，pH 7.0，酶添加量1.0mg/g，考察不同Na2SO4质量分数对分配行为的影响，为进一步研究PEG相对分子量对分配行为的影响，选取PEG2000、PEG4000、PEG6000进行实验。

1.3.5 不同PEG质量分数对分配行为的影响 固定Na2SO4质量分数16.0%，pH7.0，酶添加量1.0mg/g，考察不同PEG6000质量分数对分配行为的影响。

1.3.6 不同pH对分配行为的影响 固定16.0%（w/w） PEG6000，16.0%（w/w）Na2SO4，酶添加量1.0mg/g，考察不同pH对分配行为的影响。

1.3.7 不同酶添加量对分配行为的影响 固定16.0%（w/w）PEG6000，16.0%（w/w）Na2SO4，pH7.0，考察酶添加量对分配行为的影响。

1.4 响应面实验

在上述单因素实验基础上，采用CCD实验设计，对X1（pH），X2（Na2SO4的质量分数），X3（PEG的质量分数）三个因素进行优化，以获得最佳的双水相萃取条件，以分配系数（K）和酶活性回收率（Y，%）两个响应值（实验用酶为木瓜蛋白酶制剂，纯度较高，故分配系数和酶活性回收率应为正相关）为考察对象，实验因素的水平编码表见表1。

表1 响应面实验因素与水平编码表Table 1 Listof coded factors and levels for RSM

1.5 数据处理及分析

使用Excel和SAS 9.3软件对数据进行处理和分析，每组实验均重复3次，实验数据表示为平均值。

2 结果与分析

2.1 不同pH的酶活性

图1 不同pH的酶活性Fig.1 The activity of enzyme at different pH value

由图1可知，随着pH增大，木瓜蛋白酶的活性先增大后减小，在pH 7.0时达到最大。原因是木瓜蛋白酶是中性蛋白，且耐酸耐碱，有较宽的pH适应性[5]。

2.2 各成相试剂对木瓜蛋白酶活性的影响

由图2可知，PEG2000在低质量分数时对酶活性有一定的促进作用，但随着质量分数的增加，酶活活性比逐渐降低，可知高浓度的PEG2000对木瓜蛋白酶的活性有抑制作用。PEG4000和PEG6000对木瓜蛋白酶的活性几乎没有影响（允许误差范围内）。随着Na2SO4质量分数的增加，酶活活性比逐渐降低，对酶活性抑制作用加强，所以在实验中，Na2SO4的质量分数应小于20.0%。

图2 不同质量分数的成相剂对酶活性的影响Fig.2 Effect of concentration of ingredients on the activity of enzyme

2.3 不同相对分子量PEG对分配行为的影响

图3 不同相对分子量PEG对分配行为的影响Fig.3 Effectof differentmolecularweight PEG on partitioning behavior

由图3可知，随着PEG相对分子量的增加，分配系数和酶活性回收率都在增加。原因是实验所用的木瓜蛋白酶疏水性较强[6]，而PEG的疏水性随着相对分子量的增大而增大，则疏水性较强的木瓜蛋白酶更趋向分配于上相。

2.4 不同Na2SO4质量分数对分配行为的影响

图4 不同Na2SO4质量分数对分配行为的影响Fig.4 Effectof Na2SO4concentration on partitioning behavior

盐的正、负离子在两相间分配系数不同，两相间形成电位差，从而影响带电生物大分子的分配。无机盐浓度的不同能改变两相间的电位差。如图4所示，随着Na2SO4质量分数的增加，PEG2000/Na2SO4系统的分配系数和酶活性回收率逐渐增大，但都比较低，说明在所选取的Na2SO4质量分数范围内，PEG2000/Na2SO4系统并未达到最佳的分配效果，应继续增大Na2SO4的质量分数，但过多的Na2SO4一方面对木瓜蛋白酶的影响比较大，另一方面增加物料的使用，故舍去PEG2000/Na2SO4系统；PEG4000/Na2SO4系统的分配系数和酶活性回收率先增大后减小，在Na2SO4的质量分数为18.0%时达到最大，分配系数2.43，酶活性回收率77.54%；PEG6000/Na2SO4系统的分配系数和酶活性回收率也是先增大后减小，在Na2SO4的质量分数为16.0%时达到最大，分配系数2.52，酶活性回收率77.87%。无机盐的盐析作用是双水相成相的主要原因之一[7]，增大Na2SO4的质量分数，无机盐的盐析作用加强，木瓜蛋白酶更趋向分配于上相，但过多的无机盐对酶的活性影响很大，所以Na2SO4的质量分数不易太大。结合实验2.3，选择Na2SO4质量分数为16.0%的PEG6000/Na2SO4系统为最佳系统，不仅分配效果好，且节省物料。

2.5 不同PEG质量分数对分配行为的影响

图5 不同PEG质量分数对分配行为的影响Fig.5 Effectof concentration of PEG on partitioning behavior

如图5所示，随着PEG质量分数的增加，PEG6000/ Na2SO4系统的分配系数和酶活性回收率先增大后减小，在PEG6000质量分数为16.0%时达到最大，分配系数2.46，酶活性回收率76.52%。原因是增大PEG的用量可以增大相比，使分配系数和回收率增大，继续增大PEG的用量使体系黏度增加，阻止了相间分子转移，在两相之间形成乳化层，使下相中的酶分子滞留在两相之间，分配系数和回收率反而降低。实验选择PEG6000质量分数为16.0%构成的PEG/Na2SO4双水相体系为最佳。

2.6 不同pH对分配行为的影响

pH影响蛋白质所带电荷的种类和多少，从而影响蛋白质与体系氢键和电荷效应，最终影响酶在双水相中的分配行为，同时影响双水相体系中盐的解离度而改变相间电位差，如体系pH与蛋白质的等电点相差越大，蛋白质在两相中分配越不均匀，pH的微小变化甚至可能使蛋白质分子的分配系数改变2～3个数量级[8]。由图6可知，随着pH的增大，分配系数和酶活性回收率先增大后减小，在pH 7.0达到最大，分配系数2.41，酶活性回收率74.81%。所以实验选择pH 7.0为最佳。

图6 不同pH对分配行为的影响Fig.6 Effect of pH on partitioning behavior

2.7 不同酶添加量对分配行为的影响

图7 不同酶添加量对分配行为的影响Fig.7 Effectof the dosage of papain on the partition behavior

随着酶添加量的增加，相比显著增大，但分配系数（2.04～2.52）和酶活性回收率（69.95%～75.59%）变化并不显著。双水相体系固定后，应尽可能投入酶，可使双水相萃取处理量增大，则效率提高。由图7可知，酶添加量为3.0mg/g时分配系数和酶活性回收率达到最大，分配系数2.52，酶活性回收率75.59%，但在此条件下上相的乳化现象比较严重且相比较大，这对酶的后续加工（如干燥，PEG与酶的分离等）增加了负担。综合考虑，响应面实验固定酶添加量为1.0mg/g。

2.8 响应面实验结果及分析

对表2数据进行二次多项回归拟合，得到两个响应值的二次多项回归模型：

式（1）和式（2）的决定系数R2分别为98.21%和97.65%，说明拟合性良好。两个模型的校正R2（K：96.59，Y：95.54），表明95%以上的实验数据的变异性可用此回归模型来解释。

对表2实验数据进行方差分析，结果见表3。由表3可知，两个模型的p值＜0.01，这表明回归方程的F检验极显著，说明所拟合的二次回归方程合适。对回归方程中一次项系数的绝对值进行比较，可判断因子影响的主次性[9]。对于木瓜蛋白酶的提取，各因素对木瓜蛋白酶提取的影响从大到小依次为Na2SO4的质量分数、PEG6000质量分数、pH。表3的分析结果表明，在所选的各因素水平范围内，X1、X1X3对K和Y的影响不显著，X2、X3、X12、X22、X32、X2X3、X1X2对K和Y的影响极显著。

表2 响应面实验设计方案及结果Table 2 Experimental design and result of RSM（Uncode）

从表2以及K和Y的响应面图（图8）可以看出，X1和X2，X2和X3交互效应显著。在已建立的模型基础上，设定优化目标响应值K和Y达到最大，通过SAS软件来预测模型的最优条件：16.0%（w/w）PEG6000，17.68%（w/w）Na2SO4，pH 7.0，酶添加量1.0mg/g。为检验响应面法所得结果的可靠性采用上述优化提取条件提取木瓜蛋白酶，考虑到实际操作的便利，将提取工艺参数修正为16.0%（w/w）PEG6000，18.0%（w/w）Na2SO4，pH 7.0，酶添加量1.0mg/g。以上述条件进行实验结果的验证。预测值K（2.8）和Y（78%），相应的实验值为K（3.1）和Y（82.6%）。可知，木瓜蛋白酶的分配系数和酶活性回收率成正相关。同时，预测值和实验值的一致性非常好，表明对双水相萃取木瓜蛋白酶的条件优化是有效的。

2.9 木瓜蛋白酶的放大实验

在上述优化条件下，对木瓜蛋白酶的双水相萃取进行了实验室规模的放大实验，系统总量由原来的20.0g放大到50.0、100.0、200.0g，其分离结果写表4。由表4的结果可知，对于双水相系统，可以较好地进行线性放大。

表3 实验结果方差分析Table 3 Variance analysis of test result

表4 不同系统总重对分配的影响Table 4 Effect of different system weighton the partitioning behavior of papain

3 结论

通过单因素实验与响应面实验，确定了双水相中各因素对木瓜蛋白酶分配行为的影响规律。结果表明：Na2SO4的质量分数对分配行为的影响极显著，其次是PEG的质量分数，pH的影响相对较低。优化得到的最佳双水相分配体系：16.0%（w/w）PEG6000，18.0%（w/w）Na2SO4，pH 7.0，酶添加量1.0mg/g，常温。在上述条件下，分配系数达到3.1，酶活性回收率达到82.6%，并进行了实验室规模的放大，重复性实验结果较好，证明响应面法优化双水相萃取木瓜蛋白酶的条件是行之有效的方法，为进一步的实验研究奠定基础。

图8 K和Y（%）的响应面图Fig.8 Responsive surface and contours of K and Y（%）

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Extraction of papain in aqueous two-phase polyethylene glycol/sodium sulfate system s

WANGW ei-tao，ZHANG Hai-de*，JIANG Zhi-guo，DONG An-hua，XU Ying-hao，PENG Jian，WANG Fei
（College of Food Science and Technology，Haikou 570228，China）

The papain was separated and extracted by PEG/Na2SO4aqueous two-phase system in this study. The influence of reagent and pH value on ac tivity of papain were investigated，in the meantime，the influence of PEG w ith d ifferent molecular weights，the mass fraction of Na2SO4and PEG，pH and enzyme added on distribution behavior in aqueous two-phase system was discussed.The separation cond ition of papain in aqueous two-phase system was op tim izated by response surface method，and am p lified in laboratory scale. The study showed that：the effect of Na2SO4mass fraction on the d istribution behavior was significant，followed by PEG mass fraction，the effect of pH on the distribution behavior was not significant.The partition coefficient and recovery rate of papain in aqueous two-phase system achieved 3.1 and 82.6%under the cond ition of molecular weights of PEG6000，mass fraction of PEG 16.0%，mass fraction of Na2SO418.0%，pH7.0，enzyme added 1.0mg/g.The results showed that：the op tim ization on extraction of papain by aqueous two-phase system was feasib le and could be used to p red ict the actual.

papain；aqueous two-phase system；partition coefficient；recovery of p rotease activity

TS255.1

A

1002-0306（2014）18-0118-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.016

2013－12－09 *通讯联系人

王伟涛（1988-），男，硕士研究生，研究方向：天然产物的提取。

国家自然科学基金（31260401）。