大孔吸附树脂脱除枸杞多糖色素技术研究

鲁晓丽，刘继婷，张自萍

（宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，宁夏银川750021）

大孔吸附树脂脱除枸杞多糖色素技术研究

鲁晓丽，刘继婷，张自萍*

（宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，宁夏银川750021）

以宁夏枸杞为原料提取枸杞多糖，采用9种大孔吸附树脂对多糖提取液中色素脱除技术进行研究。在静态实验的基础上，采用正交实验筛选出色素脱除效果最佳的树脂。以脱色率、多糖保留率和蛋白清除率为指标，衡量树脂脱色效果。结果表明：D318树脂脱除色素的效果最佳，样液质量浓度3mg/mL、树脂用量3g/25mL、pH7、处理3h时D318树脂的脱色率、多糖保留率和蛋白清除率分别为67.32%、85.49%和58.76%。

枸杞多糖，大孔树脂，脱色

在天然产物研究领域中，枸杞子的功效甚多，具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、降脂降糖等诸多功能[1]。枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharides）作为枸杞子的重要活性成分，成为近年研究热点。目前，国内外对枸杞多糖的研究主要集中于活性研究，对枸杞多糖脱除色素的研究尚不多见。通常采用水提醇沉的方法[2]提取分离枸杞多糖，得到的多糖产品具有颜色深、粘度大、纯度低等特性，给活性研究带来了巨大的挑战。也有研究者采用活性炭吸附法[3]，双氧水氧化法[4]等对多糖提取液脱色。虽然这些方法可以脱除部分色素，但是这些方法存在多糖损失率大、生物活性被破坏、还原糖分解、脱色剂残留等缺陷。大孔树脂作为一类新型高分子分离材料，具有吸附量大、易洗脱、选择性好、脱色范围广、重复利用等特点。在医药研究领域的应用越来越多，尤其在天然产物的提取、分离纯化方面的应用尤为突出，并逐渐显现出其优越性[5]。陈振兴等[6]利用D-900树脂对巴戟天多糖进行了脱色工艺优化，获得了较好的脱色率以及较高的多糖保留率。邹义芳等[7]证实了大孔树脂HPD-100对红花多糖可以获得较高的脱色率和保留率，为大孔树脂的应用提供了理论依据。为了提高枸杞多糖的纯度，改善产品色泽，本实验探讨大孔吸附树脂对枸杞多糖提取液中色素的脱除效果，并对脱色条件进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

枸杞 宁夏银川园林场枸杞研究所；重蒸苯酚、浓硫酸、无水乙醇、抗坏血酸、丙酮、无水乙醚、葡萄糖 均为分析纯。

AL204电子天平、精密pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；微型高速万能粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司；DHZ-2001A大容量全温度振荡培养箱 江苏省太仓市华美生化仪器厂；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；U-5100比例光束分光光度计 Hitachi日立高新技术公司；真空冷冻干燥机 德国Christ；玻璃层析柱（Ф30mm× 400mm）；树脂型号及生产厂家见表1。

表1 大孔树脂型号及生产厂家Table 1 The type ofmacroporous resin and manufacturers

1.2 树脂预处理

将树脂用95%乙醇浸泡24h，充分溶胀后用蒸馏水洗至无醇味，然后用5%HCl溶液浸泡12h，用蒸馏水洗至中性；最后用5%NaOH溶液浸泡12h，再用蒸馏水洗至中性，60℃烘干备用[8]。

1.3 枸杞多糖的提取

[9]报道，采用微型粉碎机将枸杞粉碎，称取枸杞粉末50g，置普通回流装置中，加入石油醚500m L，60℃回流脱脂3次，每次1h。滤出溶剂，残渣风干后加入80%乙醇500m L，60℃回流3次，每次1h，回收乙醇。70℃水提3次，共6h，料液比为1∶10，合并滤液浓缩，得到深红色多糖液，真空冷冻干燥机干燥后为红褐色粉末，易溶于水。至于4℃冰箱保存备用。

1.4 测定方法

1.4.1 多糖测定 采用苯酚-硫酸法[9]，以葡萄糖为对照品。

式中，M1、M2分别为脱色前、后的多糖总量。

1.4.2 脱色率测定 将枸杞多糖提取液在波长240～ 760nm进行扫描，得到420nm处有最大吸收，即为色素的特征吸收波长[10]。

式中，A前、A后分别为脱色前、后溶液在波长420nm处的吸光度。

1.4.3 蛋白清除率测定 采用考马斯亮蓝显色法。

式中，M3、M4分别为脱色前、后的蛋白总量。

1.4.4 综合指标（OverallDesirability，OD） OD是正交设计综合评分法的衡量指标[11]。将脱色率、多糖保留率和蛋白清除率三个指标统一综合考察，以综合指标OD进行直观分析和方差分析。在计算综合指标之前，需先将各指标进行规格化。

式中，Ymax和Ymin分别为各指标可接受的最大值和最小值，最大值的选择依据是：当指标值超过最大值时，产品的质量并不能得到显著的改善，本实验中Ymax=100和Ymin=0。因此，当某各实验的指标值等于或超过Ymax时，将di=1；相反，实测指标等于或低于Ymin时，di=0。

综合指标OD=（d1d2d3…dk）1/k，k为指标数

1.5 树脂的初筛选

取9种型号的大孔吸附树脂各10g加入三角瓶中，分别加入50m L质量浓度2mg/m L枸杞多糖溶液，恒温振荡3h，通过分光光度计测定其吸光度，计算出多糖保留率、蛋白清除率、脱色率。

1.6 静态吸附实验

1.6.1 静态动力学曲线绘制 称取经预处理干燥后的D318和OU-1树脂于三角瓶中，加入一定量的枸杞多糖提取液，恒温振荡一定时间，计算枸杞多糖提取液的多糖保留率和脱色率，绘制静态吸附动力学曲线。以多糖保留率、脱色率和蛋白清除率为指标进行后续实验。1.6.2 树脂及其用量的确定 分别量取D318和OU-1树脂1.5、3、6、12g置于干净的三角瓶中，加入25m L枸杞多糖提取液，pH 7，37℃振摇2h，采用1.4方法测定其脱色率、多糖保留率和蛋白清除率。

1.6.3 样液质量浓度的确定 称取3g D318树脂于干净的三角瓶中，加入25m L质量浓度分别为1、2、3、4、5mg/m L的多糖溶液，pH 7，37℃振摇2h，采用1.4方法测定其脱色率、多糖保留率和蛋白清除率。

1.6.4 pH的确定 称取3g D318树脂于干净的三角瓶中，加入25m L质量浓度为3mg/m L的多糖溶液，分别调节pH为4、5、6、7、8、9，37℃振摇2h，采用1.4方法测定其脱色率、多糖保留率和蛋白清除率。

1.6.5 时间的确定 称取3g D318树脂于干净的三角瓶中，加入25m L质量浓度为3mg/m L的多糖溶液，pH=7，37℃振摇1、2、3、4、5、6h，采用1.4方法测定其脱色率、多糖保留率和蛋白清除率。

1.6.6 正交实验设计 根据不同树脂对多糖溶液的脱色率、多糖保留率和蛋白清除率，选取D318树脂进行正交实验。以脱色率、多糖保留率和蛋白清除率为指标，选择树脂用量、样液质量浓度和时间3个因素，各取3个水平，进行3因素3水平L9（33）正交实验设计，正交实验因素水平见表2。

表2 D318树脂正交实验设计Table 2 The orthogonal experimental design ofD318macroporous resin

1.7 验证实验

以选定D318树脂条件进行3次重复实验，测定多糖得率、脱色率和蛋白清除率。

2 结果与分析

2.1 多糖测定、蛋白质测定的标准曲线方程

多糖测定的线性回归方程为：Y＝10.57X+0.0003，相关系数r＝0.9995。其中，Y为吸光度，X为葡萄糖质量浓度（mg/m L）。

蛋白质测定的线性回归方程为：A=7.171C+ 0.0145。其中，A为吸光度，C为蛋白质浓度（mg/m L）。

2.2 树脂筛选

影响大孔树脂吸附性能的因素很多，包括树脂的结构、极性、比表面积、粒径、孔径及被吸附分子的极性、分子大小等。一般来说，树脂的极性与被吸附分子的极性相同或相近时吸附效果更好；树脂有较大比表面积时吸附量更大；树脂孔径是被吸附分子大小的5～6倍时吸附性能最好[12]。9种树脂筛选结果如表3所示。

由表3可以看出，9种树脂对色素的脱除能力也各不相同，其中脱色率最高的为D318树脂，脱色率为65.92%，其次为OU-1，61.86%；多糖的吸附量都不大，多糖保留率均在50%以上（聚酰胺除外），其中D318树脂多糖保留率高达84.80%，位居第一，其次是MG-2，78.21%；对蛋白质的去除能力比较低，蛋白清除率最高的为聚酰胺，达到69.55%，位居第二的是D318树脂，达到58.71%。综合3个指标考虑，D318和OU-1树脂综合能力较佳；其中D318和OU-1两种树脂的脱色率高于其他几种；并且D318和OU-1树脂对多糖的吸附不大，避免了多糖大量损失；另外，D318和OU-1树脂对蛋白的去除能力达到要求，在9种树脂中位居二、三位。在所选的9种大孔吸附树脂中，D318属于弱碱性阴离子交换树脂。弱碱性阴离子交换树脂含有-NH2、-NHR或-NR2等弱碱性基团[13]。OU-1属于强极性大孔吸附树脂。从两者的脱色率均较高可以推断，枸杞多糖提取液中的色素可能是弱碱性阴离子和强极性分子。

综合考虑多糖保留率、蛋白清除率、脱色率三个指标得出，D318和OU-1大孔吸附树脂的处理效果较好。因此，选择这两种树脂进行进一步的吸附实验。

2.3 静态吸附实验

2.3.1 静态动力学曲线 D318和OU-1两种树脂吸附达到饱和吸附状态，其静态吸附动力学过程曲线如图1所示。图1中的色素吸附率可以反映两种大孔吸附树脂对枸杞多糖提取液的脱色情况。由图1可知，在吸附的开始阶段，色素吸附率随着吸附时间的延长而迅速增大，之后增加缓慢。在吸附时间达到60m in后，两种树脂的吸附率均增加缓慢，不再有明显的提高，吸附时间达到270min后，吸附率基本不再增加，可以认为，此时树脂对色素的吸附已经达到了一个动态平衡。色素在D318和OU-1这种树脂上的动力学过程基本相似，但在吸附量上存在差别，D318树脂的色素吸附量略高于OU-1。

图1 静态吸附动力学曲线Fig.1 Static adsorption kinetics curve of D318 and OU-1 towards Lyciumbar barum polysaccharide

2.3.2 树脂及其用量的确定 由图2（a）可知，对于25m L枸杞多糖提取液来说，当树脂用量超过3g后，脱色率明显降低。由图2（b）可知，多糖保留率随着树脂用量的增加先增加后减小，D318树脂的多糖保留率高于OU-1树脂。图2（c）可知，蛋白清除率随着树脂量的增加而持续增加，OU-1树脂的蛋白清除率略高于D318树脂。在日常研究中，以脱色率和多糖保留率为主要指标，在尽可能降低多糖的损耗的基础上，选择脱色率和蛋白清除率相对较高的树脂。当树脂用量为3g/25m L多糖提取液时，D318树脂的脱色率为66.85%，多糖保留率为77.70%，蛋白清除率为54.89%；相同条件下，OU-1树脂的脱色率为59.51%，多糖保留率为66.32%，蛋白清除率为57.33%。综合考虑多糖溶液的脱色率、多糖保留率和蛋白清除率，选择D318树脂为最佳的树脂脱色剂，树脂用量为3g/25m L多糖提取液。

2.3.3 样液质量浓度对D318树脂吸附效果的影响 由图3可知，随着多糖溶液浓度的升高，多糖保留率变化不明显；大孔吸附树脂D318对枸杞多糖提取液的脱色率和蛋白清除率先增加后降低，当溶液质量浓度大于3mg/m L时，脱色率和蛋白清除率迅速下降。且在质量浓度3mg/m L时多糖保留率也相对较高，因此，选择质量浓度3mg/m L的多糖溶液进行后续实验。

2.3.4 pH对D318树脂吸附效果的影响 由图4可知，随着多糖提取液pH的增大，大孔吸附树脂D318对枸杞多糖提取液的脱色率在pH7以后急剧下降，在pH 6～7范围内脱色率达到最高。因为D318树脂是大孔弱酸性丙烯酸系阴离子交换树脂，能在近中性条件下吸附分子尺寸较大的杂质。枸杞多糖提取液中的色素在pH6～7时，更容易被吸附。偏酸性和碱性条件下脱色率较低，可能是由于在碱性条件下部分还原糖发生了美拉德反应[14]，故颜色较深，影响了脱色效果。随着多糖溶液pH的增大，枸杞多糖提取液的多糖保留率先增大后减小，pH 7时的多糖保留率最高。因此综合考虑枸杞多糖提取液的脱色率、蛋白清除率和多糖保留率，pH 7最合适。

表3 9种树脂对枸杞多糖提取液的脱色实验结果Table 3 Effect of nine types of resins on the decolorization of Lycium barbarum polysaccharide

图2 树脂用量与脱色效果的关系曲线Fig.2 Effectof resin amounton decolorization

图3 多糖质量浓度对D318树脂吸附效果的影响Fig.3 Effectof polysaccharide concentration on the adsorption efficiency of resin D318

图4 pH对D318树脂吸附效果的影响Fig.4 Effectof pH on the adsorption efficiency of resin D318

图5 时间对D318树脂吸附效果的影响Fig.5 Effectof time on the adsorption efficiency of resin D318

2.3.5 时间对D318树脂吸附效果的影响 由图5可知，随着脱色时间延长，大孔吸附树脂D318对枸杞多糖提取液的脱色率先缓慢升高后下降，在3h时脱色率达到最高。因为D318树脂是大孔弱酸性丙烯酸系阴离子交换树脂，存在吸附饱和度，一定时间内已经达到了D318树脂的最高吸附容量。随着脱色时间的延长，枸杞多糖提取液的多糖保留率和蛋白清除率也是先增大后减小，3h时的多糖保留率最高。因此综合考虑枸杞多糖提取液的脱色率、蛋白清除率和多糖保留率，3h为宜。

2.3.6 正交实验结果 根据单因素实验结果，以树脂用量、样液质量浓度和时间为考察因素，以脱色率、多糖保留率和蛋白清除率为考察指标，选取L9（33）正交表进行大孔树脂影响因素正交实验，并进行极差分析和方差分析，以确定最佳提取条件。实验结果见表4。

由表4中的实验结果可以得出，各因素对大孔树脂脱色效果的影响程度依次为A＞C＞B，即树脂的用量对枸杞多糖脱色效果影响最大，其次时间，样液质量浓度影响最小。综合各因素比较，其最佳提取条件为：A2B2C2，树脂用量3g/25m L、样液质量浓度3mg/m L、时间3h。

2.4 验证实验

在正交实验确定的最佳提取条件下，平均多糖保留率为85.49%，平均脱色率为67.32%，平均蛋白清除率为58.76%，有较佳的脱色纯化效果，由此证明该工艺在生产上具有可行性。

3 结论

通过比较X-5、AB-8、OU-1、D318、D315、MG-2、D301G、D-900、聚酰胺九种大孔吸附树脂对枸杞多糖提取液的脱色率、多糖保留率和蛋白清除率，得出D318和OU-1树脂为较好的脱色剂，D318和OU-1树脂脱色率分别为65.92%和61.86%，多糖保留率分别为84.80%和73.05%。进一步比较D318和OU-1树脂的静态吸附动力学过程和树脂用量、样液浓度、pH和时间对脱色率、多糖保留率和蛋白清除率的影响，D318树脂的静态吸附量高于OU-1。通过静态实验得到，样液质量浓度3mg/m L、树脂用量3g/25m L、pH=7、处理3h，得出D318树脂的脱色率、多糖保留率和蛋白清除率分别为67.32%、85.49%、58.76%。因此，最终选出D318树脂为枸杞多糖提取液的最佳脱色剂。

表4 正交实验结果Table 4 Results of orthogonal experiment

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Study on the pigment removal from Lycium barbarum polysaccharides by macroporous resin

LU Xiao-li，LIU Ji-ting，ZHANG Zi-ping*
（Key Laboratory of Chinese Ministry of Education for Conservation and Utilization of Special Biological Resources in theWestern，Ningxia University，Yinchuan 750021，China）

The removal of p igments from crude polysaccharides from Lycium barbarum was investigated.With the orthogonalexperiment，D318 was found to be the bestadsorbent for p igments in lycium barbarum among 9 types ofmacroporous adsorp tion resin tested.On the basis of static adsorp tion experiments，the removal rate of p igments was 67.32%，the retention rate of polysaccharides 85.49%and the p rotein c learance rate 58.76% when 25m L of 3mg/m L crude polysaccharide solution at pH7.0 and 3h was made to flow through 3g of D318 column at a velocity of 3mg/m L.In conc lusion，the resin was suitab le for the decolorization of polysaccharides from Lycium barbarum.

Lycium barbarum polysaccharides；macroporous adsorp tion resin；decolorization

TS255.1

B

1002-0306（2014）18-0293-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.057

2013－11－19 *通讯联系人

鲁晓丽（1988-），女，在读硕士研究生，主要从事宁夏枸杞的化学成分及活性方面的研究。