青稞蛋白质碱法提取条件的优化研究

谢昊宇，贾冬英，迟原龙，姚 开

（四川大学轻纺与食品学院，四川成都610065）

青稞蛋白质碱法提取条件的优化研究

谢昊宇，贾冬英*，迟原龙，姚 开

（四川大学轻纺与食品学院，四川成都610065）

采用碱提酸沉法制备青稞粗蛋白，以蛋白质提取率为考察指标，采用单因素实验研究了NaOH浓度、料液比、提取温度和时间对青稞蛋白质提取的影响，运用正交实验优化了其碱法提取条件。结果显示，该4种因素对青稞蛋白质提取表现出不同程度的影响，前3种因素对青稞蛋白质提取的影响大小依次为NaOH浓度、料液比和提取温度。在提取时间为1.0h时，青稞蛋白质碱法提取的优化条件为：料液比1∶12g/mL、NaOH浓度为0.15%、提取温度55℃。青稞蛋白质酸沉pH为4.5。按此条件制备青稞粗蛋白，其提取率和蛋白质含量分别达到72.36%和83.35%。

青稞，蛋白质，碱提，酸沉，条件优化

青稞也称“裸大麦”，属于禾本科大麦属植物，主要产于我国西藏、青海、四川、云南等地区，是这些地区藏族居民的主食。据分析，青稞的蛋白质含量为11.37%[1]，略低于小麦和燕麦，但高于其他谷物。青稞蛋白质主要包括谷蛋白（43.83%）和醇溶蛋白（18.25%）[2]。已有研究证实，青稞蛋白质含有18种氨基酸，包括8种必需氨基酸，尤其富含大米和小麦等谷物蛋白质中缺乏的赖氨酸，其含量达0.36g/100g[3]。因此，较这些谷物蛋白质具有更高的营养价值。可用于植物组织中蛋白质提取的方法有碱提法、物理法[4]和酶法[5]。碱提法因具有操作简单、可同时完成蛋白质和淀粉的分离、提取效率高的特点而成为植物蛋白质提取最常用的方法。该方法是基于碱液可使与蛋白质结合的淀粉紧密结构变得疏松，同时对蛋白质分子的次级键尤其是氢键具有破坏作用，导致一些极性基团发生解离，从而对蛋白质分子起到增溶作用，促进蛋白质与淀粉的分离[6]。目前，国内外有关青稞淀粉和β-葡聚糖的提取及其功能特性研究较多，而有关青稞蛋白质的碱法提取条件研究则报道较少。基于此，本论文中采用碱提酸沉法制备青稞蛋白质，在单因素实验的基础上，运用正交实验对青稞蛋白质的碱法提取条件进行优化，期望获得的结果能为青稞资源的高附加值利用提供有价值的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

青稞粉 来自西藏日喀则地区；氢氧化钠、盐酸、浓硫酸、硼酸、硫酸铜、硫酸钾 均为国产分析纯试剂。

TDL-60B型离心机 上海安亭科学仪器厂；MODEL-3型旋转蒸发器 上海医械专机厂；HZS-H型水浴振荡器 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；PHS-3C型精密pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 青稞蛋白质等电点测定 取20g青稞粉，加入240m L 0.10%NaOH溶液，在50℃下振荡提取1.0h后定容至500m L，混匀后取20m L上清液6份，用1.0mol/L盐酸分别调其pH至3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，于4000r/m in下离心15m in后取上清液，于280nm处测其吸光度[7]。结果显示，pH为4.5时上清液的吸光度最小，由此确定青稞蛋白质的等电点为4.5。

1.2.2 青稞粗蛋白的制备 青稞蛋白质的制备方法如下：按照一定的料液比加入一定浓度NaOH溶液于青稞粉中，于一定温度下振荡提取一定时间后于4000r/m in下离心15m in，取上清液，用1mol/L盐酸调节其pH至4.5，静置30m in后于4000r/m in下离心15m in，将沉淀物用蒸馏水洗涤，于50℃下烘干至恒重得到青稞粗蛋白。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 NaOH浓度的选择 按1∶12g/m L的料液比，分别加入浓度为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%（w/v）的NaOH溶液，于50℃下振荡提取1.0h，制备青稞粗蛋白，测定粗蛋白提取率。

1.2.3.2 提取温度的选择 按1∶12g/m L的料液比加入0.1%（w/v）NaOH溶液，分别在40、45、50、55、60℃下振荡提取1.0h制备青稞粗蛋白，测定粗蛋白提取率。1.2.3.3 提取时间的选择 按1∶12g/m L的料液比加入0.1%（w/v）NaOH溶液，在50℃下分别振荡提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h制备青稞粗蛋白，测定粗蛋白提取率。

1.2.3.4 料液比的选择 称取10.0g青稞粉5份，分别加入其质量6、8、10、12、14倍的0.1%（w/v）NaOH溶液，于50℃下振荡提取1.0h制备青稞粗蛋白，测定粗蛋白提取率。

1.2.4 青稞蛋白质碱提条件优化 根据单因素实验结果，以料液比（A）、NaOH浓度（B）、提取温度（C）为考察因素，以蛋白质提取率为考察指标，采用正交实验（见表1）对青稞蛋白质的碱提条件进行优化。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.5 蛋白质含量的测定 采用GB/T 5009.5-2003凯氏定氮法测定青稞粉和青稞粗蛋白中的蛋白质含量。1.2.6 青稞粗蛋白提取率的计算 提取率（%）=[m/（M× ω）]×100

式中，m为青稞粗蛋白的质量（g）；M为青稞粉的质量（g）；ω为青稞粉中蛋白质的质量分数（g/100g）。

1.3 数据处理

每组实验重复3次，结果取平均值。采用Origin 7.5软件作图。

2 结果与讨论

2.1 青稞粉蛋白质含量的测定

采用凯氏定氮法测定了青稞粉中的蛋白质含量，结果显示其含量为9.2g/100g。

2.2 单因素实验

2.2.1 NaOH浓度对青稞蛋白质提取的影响 一般来说，大多数植物蛋白为酸性蛋白质，其在碱性溶液中的溶解度明显高于酸性溶液，故通常以碱性溶液作为溶剂进行提取。NaOH浓度对青稞蛋白质提取效果的影响见图1。可以看出，随着NaOH浓度的提高，青稞蛋白质提取率呈现先增加后减少的趋势。在NaOH浓度为0.10%～0.20%时，蛋白质提取率较高；NaOH浓度小于0.05%或者超过0.20%时，蛋白质提取率则相对较低。这是因为青稞蛋白质的溶解性随NaOH浓度增加而增大。而NaOH浓度过高不仅会造成蛋白质变性，促进美拉德反应的发生，导致必需氨基酸的损失，同时降低蛋白质的营养价值和提取率，而且会显著增加提取液的粘度，不利于后续的离心分离，造成蛋白质的损失较多。综合考虑，确定青稞蛋白质提取的适宜NaOH浓度为0.15%；按实际操作情况，NaOH浓度选择0.05%～0.15%。

图1 NaOH浓度对青稞蛋白质提取的影响Fig.1 Effectof NaOH solution concentrations on the extraction of proteins from highland barley

图2 提取温度对青稞蛋白质提取的影响Fig.2 Effectof temperatures on the extraction of proteins from highland barley

2.2.2 提取温度对青稞蛋白质提取的影响 温度是影响固液萃取中有效成分溶出的重要因素之一，在适宜温度范围内，有效成分的溶出会随着温度的升高而增加，但超过适宜温度后其溶出量反而表现出下降的趋势。提取温度对青稞蛋白质提取的影响见图2。可以看出，提取温度对青稞粗蛋白的提取存在较大的影响。在40～50℃时，青稞蛋白质提取率随着提取温度的增加而增大，50℃时达到最大值；之后随着温度升高，蛋白质提取率反而有所下降。该结果与管骁[8]和黄来珍[9]报道的结果相似。这是因为在适宜的温度范围内，温度升高不仅可加快蛋白质分子与水分子的运动，还可使蛋白质分子的立体结构得到更好的伸展，提高蛋白质溶解度[10]，促进蛋白质的溶出。而提取温度过高则容易造成蛋白质变性和淀粉糊化，增加提取液的粘度，不利于蛋白质的溶出，从而降低蛋白质提取率。所以，确定青稞蛋白质适宜提取温度为50℃。

2.2.3 提取时间对青稞蛋白质提取的影响 提取时间对青稞蛋白质提取的影响见图3。可以看出，青稞蛋白质提取率随着提取时间增加表现出先增大后稳定的趋势。提取时间在1.0h之内，随着提取时间的增加，青稞蛋白质提取率增大较为明显，1.0h后青稞蛋白质提取率随时间变化增加的幅度很小。这是因为青稞蛋白质从粉料中溶出需要一定时间，随着时间增加其溶出量会逐渐增大，当达到最大溶出量，即溶出达到动态平衡时，增加提取时间对蛋白质溶出影响不大。因此，从提取效率和经济角度考虑，确定青稞蛋白质的适宜提取时间为1.0h。

图3 提取时间对青稞蛋白质提取的影响Fig.3 Effectof time on the extraction of proteins from highland barley

2.2.4 料液比对青稞蛋白质提取的影响 料液比对青稞蛋白质提取的影响见图4。可以看出，随着料液比的增大，青稞蛋白质提取率呈现先增加后减少的趋势，在1∶12g/m L达到最大值。这是因为溶剂的量增多，会增大青稞粉与溶剂的接触面积，增大其浓度差，加速蛋白质的溶出。因此，在料液比为1∶6～1∶12g/m L范围内，蛋白质提取率升高较为明显。由于青稞粉富含可溶性β-葡聚糖，其在水溶液中能产生很高的粘度，妨碍蛋白质提取中传质过程的进行，故只有当碱液提取的溶出效应与β-葡聚糖的阻遏效应达到平衡时，才能使粗蛋白的提取率达到峰值[11]。此外，过大的料液比会造成提取液中蛋白质浓度偏低，不利于后续的蛋白质絮凝沉淀，同时还会增加废水产生量和处理成本。综合考虑，确定青稞蛋白质提取的适宜料液比为1∶12g/m L；为节约成本料液比选1∶8～1∶12。

图4 料液比对青稞蛋白质提取的影响Fig.4 Effect ofmaterial-liquid ratios on the extraction of proteins from highland barley

2.3 青稞蛋白质碱提正交实验

由于提取时间达到1.0h后青稞蛋白质的提取率随提取时间增加变化很小，因此确定青稞蛋白质碱法提取的适宜时间为1.0h。在固定提取时间为1.0h条件下，采用正交实验考察料液比（A）、NaOH浓度（B）和提取温度（C）3种因素对青稞蛋白质提取率的影响，结果见表2。由表中极差值R可知，该3种因素对青稞蛋白质提取率影响大小依次为NaOH浓度、料液比和浸提温度，其中NaOH浓度是影响青稞蛋白质提取率的主要因素。因此青稞蛋白质碱法提取的最佳工艺条件为A3B3C3，即料液比为1∶12g/m L、NaOH浓度为0.15%、提取温度为55℃。按此优化条件对青稞粉中的蛋白质提取3次，将得到的提取液于pH4.5下进行沉淀，得到蛋白质含量为83.35%的青稞粗蛋白，其提取率为72.36%。这一结果高于刘光明等[11]在pH 9.5、料液比1∶10g/m L、温度45～50℃、时间90m in条件下燕麦浓缩蛋白的提取率（67.24%），但略低于王金水等[12]采用水酶法提取青稞米籽粒中蛋白质的提取率（69.40%）。

表2 正交实验结果及其分析Table 2 Results from orthogonal experimentand their analysis

3 结论

本论文中采用碱提酸沉法制备青稞蛋白质，重点研究了青稞蛋白质的碱提条件。青稞蛋白质的提取受NaOH浓度、料液比、提取温度和提取时间的影响。前3种因素对青稞蛋白质提取的影响大小依次为NaOH浓度、料液比和提取温度。在提取时间为1.0h时，青稞蛋白碱法提取的优化条件为：料液比为1∶12g/m L、NaOH浓度为0.15%、提取温度为55℃。为了使青稞中的蛋白质得到充分提取，有必要深入研究超声波辅助、微波辅助和酶法辅助等其他辅助提取方法对其提取的影响。

[1]臧靖巍，阚建全，陈宗道，等.青稞的成分研究及其应用现状[J].中国食品添加剂，2004（4）：43-46.

[2]李涛，王金水.青稞蛋白质的提取及其特性研究[D].河南：河南工业大学出版社，2010.

[3]王鹏珍，牛忠海，张世满.青稞原料营养成分浅析[J].酿酒科技，1997，81（3）：30-31.

[4]Vasanthan T，Bhatty R S.Starch purification after pin milling and air-classification of waxy，normal and high amylose barleys [J].Cereal Chem，1995，72（4）：379-384.

[5]葛娜，易翠平，姚惠源.碱性蛋白酶提取大米水解蛋白的研究[J].粮食与饲料工业，2006（4）：25-27.

[6]王文高，陈正行，姚惠源.不同蛋白酶提取大米蛋白质的研究[J].粮食与饲料工业，2002（2）：41-42.

[7]李凤英，崔蕊静，李春华.葡萄籽蛋白质的提取工艺研究[J].中国油脂，2005，30（4）：50-53.

[8]管骁，姚惠源，陈正行.碱提酸沉法制备燕麦麸浓缩蛋白的工艺及其改进[J].粮食与饲料工业，2006（4）：22-24.

[9]黄来珍，谢伟彬，邵海艳.大豆饼粕分离蛋白的制取工艺研究[J].食品研究与开发，2011，32（9）：53-56.

[10]杜琨，何日光，张亚宁.提高核桃乳蛋白质提取率的工艺研究[J].食品研究与开发，2007，28（11）：105-107.

[11]刘光明，李林.碱提酸沉法制备燕麦浓缩蛋白的工艺研究[J].湖南文理学院学报：自然科学版，2011，23（1）：60-62.

[12]王金水，李涛，焦健.水酶法提取青稞蛋白工艺研究[J].食品工业科技，2010，31（9）：267-269.

Study on condition optim ization of extracting proteins from highland barley by alkaline

XIE Hao-yu，JIA Dong-ying*，CHIYuan-long，YAO Kai
（College of Light Industry&Food Science，Sichuan University，Chengdu 610065，China）

Crude p rotein from highland barely powder was p repared by the method of alkaliextraction and acid p recipitation.With the extraction rate of c rude p rotein as an index，the effects of NaOH concentration，materialliquid ratio，extraction temperature and time on the extrac tion were investigated.The extrac tion cond ition was op tim ized by orthogonalexperiment.The results showed that the fac tors affected the extraction of p roteins from highland barley in the p redom inantorder ofNaOH concentration，material-liquid ratio and extraction tem perature. When the extraction time was 1.0h，an op timum extrac tion cond ition for the c rude p rotein was obtained，that was，NaOH concentration of 0.15%，material-liquid ratio of 1∶12g/m L and extraction temperature of 55℃.The p recipitation pH value of p roteins from highland barely was 4.5.Under the above cond itions，the extraction rate of crude p rotein from highland barely and its p rotein contentwas 72.36%and 83.35%，respectively.

highland barely；p roteins；alkaliextraction；acid p recipitation；condition op tim ization

TS210.1

B

1002-0306（2014）18-0281-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.054

2013－11－25 *通讯联系人

谢昊宇（1990-），男，硕士研究生，研究方向：食品工程。