硒化蒲公英多糖的制备工艺及硒含量测定的研究

葛明明，胡 北，孙丽娜，李建惠，侯 巍，高金波，*

（1.黑龙江省教育厅生物药制剂重点实验室，佳木斯大学药学院，黑龙江佳木斯154007；2.黑河学院，物理化学系，黑龙江黑河164300）

硒化蒲公英多糖的制备工艺及硒含量测定的研究

葛明明1，胡 北1，孙丽娜2，李建惠1，侯 巍1，高金波1，*

（1.黑龙江省教育厅生物药制剂重点实验室，佳木斯大学药学院，黑龙江佳木斯154007；2.黑河学院，物理化学系，黑龙江黑河164300）

根据有机硒化合物的合成原理，以蒲公英多糖与亚硒酸钠为原料制备蒲公英硒多糖。利用单因素和正交实验探讨最佳工艺条件；利用HPLC法测定蒲公英硒多糖中的硒含量，并通过红外光谱和差示扫描量热法对硒多糖进行了初步表征。结果表明，最佳工艺条件为蒲公英多糖与亚硒酸钠质量比为1∶1.2，硝酸体积分数为0.3%，反应温度70℃，反应时间8h。蒲公英硒多糖的平均硒含量为3.79mg/g，平均收率为33.58%。红外光谱显示：蒲公英硒多糖中含有Se=O键和Se-C键，实现了蒲公英多糖的硒化，可为进一步的开发和利用提供良好的条件。

蒲公英多糖，亚硒酸钠，制备，结构表征

蒲公英（Taraxacum mongolicum）又名黄花地丁、婆婆丁、黄花三七等，为菊科多年生草本植物[1]，具有清热消肿、抗菌、利尿通淋等功效[2]。近年来的研究发现，蒲公英多糖具有免疫调节[3]、抗肿瘤[4]、抗疲劳[5]、抗氧化[6]、降血糖[7]等作用。硒是人体所必需的微量元素[8]，可延缓衰老，防治癌症和心血管疾病。人体若硒含量失调会导致糖尿病、克山病和大骨节病等[9]，适量补硒对提高机体免疫力、解毒、抑制衰老、预防疾病有重要意义[10-12]。因此，将硒与多糖结合使之成为有机硒化合物—硒多糖，不仅保持了多糖的基本构型和活性，还很大程度提高了生物可利用度，降低了毒性和副作用，与无机硒相比，还具有生物活性强，环境污染小等特点[13-14]。近几年，国外主要研究有机硒药物的合成及其生物体内的作用机制，但对于硒多糖的研究尚未成熟[15]。硒多糖主要来源于天然硒多糖和合成硒多糖[16]，国内外已有学者通过化学手段合成硒多糖[17-20]。目前，中国营养学会推荐的成人摄入量为每日50～250μg，而我国2/3地区硒摄入量低于最低推荐值[21-22]，因此，本实验以蒲公英多糖和亚硒酸钠为原料，硝酸为催化剂，制备了蒲公英硒多糖，并考察了合成工艺的条件，结果该合成工艺简单、安全、对环境污染较小、合成产物得率较高，为蒲公英硒多糖作为食品添加剂补充食物硒的缺乏奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蒲公英多糖 自制，多次纯化所得均一多糖[23]；Se元素标准溶液 中华人民共和国标准物质中心；亚硒酸钠 分析纯，上海新宝精细化工厂；硝酸 分析纯，北京化工厂；盐酸、高氯酸 分析纯，固安县金荣化工有限公司。

Agilent1100型高效液相色谱仪 美国Agilent公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 武汉科尔仪器设备有限公司；傅里叶红外光谱仪 塞莫尔飞式科技；透析袋MD10 上海欧韦达仪器科技有限公司。

1.2 硒化蒲公英多糖的制备

1.2.1 硒化反应 准确称取0.5g一定质量的蒲公英多糖放入三颈瓶中，加入一定体积分数0.5%硝酸溶液，加热搅拌使多糖全部溶解，加入一定质量比亚硒酸钠，70℃搅拌反应8h，待反应完毕，将反应液降至室温。

1.2.2 除去未反应的亚硒酸根离子 将降温后的反应液用无水碳酸钠调pH 5～6，离心（7000r/m in，15m in），抽滤，滤液经流水透析，取透析液少量，加入抗坏血酸检测，无红色时停止透析。

1.2.3 乙醇沉淀硒多糖[24]用3倍体积无水乙醇沉淀，-4℃冰箱中放置过夜，0.22μm微孔滤膜过滤，用无水乙醇洗涤沉淀数3次，在-0.8kPa，30℃下真空干燥，得硒多糖。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 原料配比对硒含量及收率影响 蒲公英多糖和亚硒酸钠的质量比分别为1∶0.6、1∶0.8、1∶1.0、1∶1.2、1∶1.4，加入的硝酸体积分数为0.5%，加热时间8h、反应温度70℃，测其硒含量及收率。

1.2.4.2 催化剂质量对硒含量及收率的影响 其他反应条件不变按照以上方法合成硒多糖，即硝酸体积分数分别为：0.1%、0.3%、0.5%、0.8%、1.0%，蒲公英多糖与亚硒酸钠质量比为1∶1.2、反应时间为8h、反应温度为70℃，测其硒含量及收率。

1.2.4.3 反应温度对硒化修饰结果的的影响 改变反应温度，使其分别在50、60、70、80、90℃时搅拌，此时，蒲公英多糖与亚硒酸钠质量比为1∶1.2、硝酸体积分数为0.3%、反应时间为8h，测其硒含量及收率。

1.2.4.4 反应时间对硒化修饰结果的的影响 改变反应时间，使其反应时间分别为4、6、8、10、12h，此时，硝酸体积分数0.3%，蒲公英多糖与亚硒酸钠质量比为1∶1.2，反应温度为70℃，测其硒含量及收率，其收率公式为：收率（%）=（蒲公英硒多糖的质量/蒲公英多糖的质量）×100

1.2.5 正交实验 在单因素实验的基础上，选用原料质量配比（蒲公英多糖∶亚硒酸钠）（A）、硝酸体积分数（B）、反应温度（C）、反应时间（D）4个因素进行L9（34）正交实验，因素水平见表1。

表1 正交实验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3 HPLC法测定硒化蒲公英多糖中硒含量

1.3.1 色谱条件 色谱柱为：ZORBAX Eclipse XDBC18，520mm×4.6mm i.d；流动相：甲醇∶水=45∶55；检测波长：330nm；流速是1.0m L/m in；柱温：室温。

1.3.2 样品消解的处理方法

1.3.2.1 消解液的优化 考察比较HNO3-HC1O4（4∶1）、HNO3-H2O2（1∶1）、HNO3-H2SO4（1∶1）体系对消解结果的影响。

1.3.2.2 样品溶液的制备 准确称取20.00mg蒲公英硒多糖置入试管中，加入混合消解液（浓硝酸、高氯酸按体积比4∶1混合）1m L，冷消化至过夜。然后将试管置于100℃水浴锅中加热6h。当试管内黄褐色气体排尽后，取出试管冷却，加入6mol/L HCl 2.5m L，置于沸水浴中，至溶液呈现无色或淡黄色，即达到终点。取出试管，冷却，再将溶液移入10m L容量瓶，定容至刻度，待测。

1.3.3 硒标准曲线的绘制 取pH2.8的柠檬酸-磷酸氢二钠的缓冲溶液3m L置于试管中，准确量取消解后的硒标准溶液（1.0mg/m L）一定体积和邻苯二胺溶液（1.0mg/m L）1m L，40℃反应100m in后加磷酸氢二钠溶液调pH至中性，然后将反应液转入10m L容量瓶，定容，使其硒的终浓度分别为0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μg/m L，进样量为20μL，以硒浓度为横坐标X，色谱峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线。

1.4 硒化蒲公英多糖的表征

红外光谱：采用KBr压片法，在4000～400cm-1范围内扫描。

差示扫描量热法：采用DE-6300型综合热分析仪对样品进行热分析，升温速率10℃·m in-1，升温范围25～600℃。气氛为静态氮气；参比物为A l2O3，分别对蒲公英硒多糖、蒲公英多糖、亚硒酸钠和蒲公英多糖与亚硒酸钠物理混合样品进行热谱扫描。

1.5 数据处理

运用SPSS统计软件进行数据分析，Excel作图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 原料配比对硒含量及收率的影响 结果如图1所示，蒲公英多糖和亚硒酸钠的质量比分别为1∶0.8、1∶1.0、1∶1.2时，硒含量及收率是随亚硒酸钠的增大而增大，当1∶1.2时，硒含量及收率达到最高；而后，随着亚硒酸钠质量的增加，硒含量及收率反而降低，这说明多糖与亚硒酸钠之间的反应存在着相互依存的关系。

图1 原料配比对硒含量及收率的影响Fig.1 Effecton contentand yield of Se by rawmaterial ratio

2.1.2 催化剂质量对硒含量及收率的影响 结果如图2所示，当硝酸体积分数由0.1%～0.3%时，硒多糖中硒含量及收率呈上升趋势；而后，随着硝酸体积分数的增加，硒含量及收率开始降低，可能是由于硝酸的氧化性增强，使某些多糖链断裂的结果。

图2 硝酸体积分数对硒含量及收率的影响Fig.2 Effecton contentand yield of Se by volume fraction of HNO3

2.1.3 反应温度对硒含量及收率的影响 结果如图3所示，温度增加反应速度加快，在50～70℃的范围内，硒多糖的硒含量及收率均随温度的升高而增加，当反应温度为70℃时，硒含量及收率达到最大；70℃以后温度虽然升高，但硒含量及收率均有所下降，可能与有机硒的稳定性相关，所以温度不能过高，以50～ 70℃为宜。

图3 反应温度对硒含量及收率的影响Fig.3 Effecton contentand yield of Se by reaction temperature

2.1.4 反应时间对硒含量及收率的影响 结果如图4所示，在反应时间4～6h时，硒多糖的硒含量及收率随着时间的延长而增加，当反应时间为8h时，硒多糖的硒含量与收率交于一点，而后硒含量及收率明显下降，可能反应时间过长会降解多糖，使其收率大幅降低。

图4 反应时间对硒含量及收率的影响Fig.4 Effecton contentand yield of Se by reaction time

2.2 正交实验结果与分析

正交实验结果与分析见表2，方差分析见表3。

表2 正交实验及结果Table 2 Results of orthogonal experiment

由表2及表3可知，影响硒含量的四个因素由大到小为：A＞B＞C＞D，即蒲公英多糖和亚硒酸钠的质量比是影响硒含量的主要因素，其次是硝酸体积分数，最佳工艺条件是A3B2C2D3；而影响蒲公英硒多糖收率的四个因素大小为：A＞C＞B＞D，说明蒲公英多糖和亚硒酸钠的质量比对收率的影响最大，最佳工艺条件是A3B2C2D2。由于在两者的最佳工艺中，只有D不同，而D又是两者影响最小的因素，再结合单因素的考察结果分析，最终确定其优化方案确定为A3B2C2D2。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

2.3 蒲公英硒多糖的最佳工艺条件的验证实验

根据上述优化结果，在蒲公英多糖与亚硒酸钠的质量比为1∶1.2，硝酸体积分数为0.3%，反应温度为70℃，反应时间为8h的优化条件下，制备了5批蒲公英硒多糖，测得其平均硒含量为3.79mg/g，平均收率为33.58%，通过验证此条件下制备的蒲公英硒多糖其收率及硒含量均较高。

2.4 消解液的优化结果

实验对三种体系消解液比较的结果：采用HNO3-HC1O4（4∶1）体系消解时，不但消解时间短，且消解液澄清，获得的色谱峰面积较大。而HNO3-H2SO4（1∶1）体系，虽消解时间短和消解液澄清，但获得的色谱峰面积较小；HNO3-H2O2（1∶1）体系，不但耗时长，而且硒的损失最大。因此，本实验选用HNO3-HC1O4（4∶1）体系对样品进行消解时的。

2.5 硒含量的测定与方法验证

2.5.1 标准曲线的绘制与结果 按1.3.1项下色谱条件进样20μL，以浓度为横坐标X，吸收峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，并进行线性回归。求得回归方程为：Y=290.49X+6.7044，相关系数R=0.9998，线性范围为0～5.0μg/m L。

2.5.2 精密度实验 按1.3.3项下的反应操作，以终浓度为0.5μg/m L的含硒溶液，连续重复进样6次，测定色谱峰面积，计算RSD值为1.38%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性实验 按1.3.3项下的反应操作，以终浓度为0.5μg/m L的含硒溶液，分别于0、2、4、6、12、24h时测定其色谱峰面积，计算RSD值为2.10%，表明样品溶液在24h内稳定。

2.5.4 重复性实验 精密称取六份样品按1.3.2.2项下方法处理，按1.3.3项下反应操作，微孔滤膜过滤，20μL进样，测定色谱峰面积，计算RSD值为1.73%，表明方法重复性良好。

2.5.5 加标回收率实验 准确量取已知硒含量的同一样品9份，3份为一组，将3组样品分别加入高、中、低浓度的硒标准溶液，按1.3.2.2项下方法处理，按1.3.3项下反应操作，测定色谱峰面积，计算平均回收率为99.8%，RSD值为1.22%。

2.6 硒化蒲公英多糖的表征与分析

2.6.1 红外扫描图 采用FTIR-8900红外光谱仪，用KBr压片法测定蒲公英多糖和蒲公英硒多糖的红外谱图。谱图如图5所示。

图5 蒲公英硒化多糖和蒲公英多糖的红外光谱Fig.5 Infrared spectrogram of taraxacum Se polysaccharide and taraxacum polysaccharide

由图5可知，硒化前、后蒲公英多糖的红外光谱有所变化，但变化不大，这说明蒲公英多糖硒化前、后基本结构没有大的改变。3433cm-1（O-H）为多糖的特征峰，此处峰强度减弱，说明-OH数量减少，2927cm-1和2853cm-1处峰强度较大，说明其（C-H）振动偶极矩加大，与多糖相比较，硒多糖在1738cm-1的峰突出有明显，1634cm-1也随之加强，这可能是Se=O形成的并与C=O相互作用的结果，经红外光谱数据[25]可知：1264cm-1处峰的增强及417cm-1处多出峰都说明Se-C的存在，720cm-1多出的SeO32-特征吸收峰，1099cm-1处多出峰为Se-O-C特征吸收峰。由此推断：多糖分子中的-OH与H2SeO3分子中的-OH脱去1个水分子后形成亚硒酸酯的结果。因此，蒲公英多糖的硒化是成功的。

图6 差示扫描量热曲线Fig.6 Differential scanning calorimetry curve

2.6.2 差示扫描量热分析 由蒲公英硒多糖与蒲公英多糖、亚硒酸钠和蒲公英多糖与亚硒酸钠物理混合的差示扫描量热分析曲线（见图6）比较分析可知，蒲公英硒多糖在25～400℃处仍保持蒲公英多糖的基本特征，亚硒酸钠在493℃处的峰和蒲公英多糖与亚硒酸钠物理混合在536℃处的峰消失，说明硒的存在形式发生了改变，由无机硒转换成为有机硒。

3 结论

本文研究表明：以蒲公英多糖和亚硒酸钠为原料，以硝酸为催化剂，用乙醇进行沉淀制备蒲公英硒多糖的工艺路线简单可行。通过单因素实验和正交实验，确定了最佳工艺条件。最佳工艺条件为原料质量配比1∶1.2、硝酸体积分数为0.3%、反应时间8h、反应温度70℃。最佳工艺条件下蒲公英硒多糖中硒含量为3.79mg/g，平均收率为33.58%。红外光谱显示：蒲公英硒多糖中含有Se=O键和Se-C键，实现了蒲公英多糖的硒化。且实现了将无机硒转化为有机硒，为蒲公英的开发、蒲公英多糖的再利用奠定基础。

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Study on preparation and content determ ination of taraxacum polysaccharide selenide

GE M ing-m ing1，HU Bei1，SUN Li-na2，LIJian-hui1，HOUWei1，GAO Jin-bo1，*
（1.The key Laboratory of Biological Drugs，Education the Department of Heilongjiang Province，Pharmacy College of Jiamusi University，Jiamusi154007，China；2.Heihe University，Physical Chemistry Department，Heihe 164300，China）

The selenide taraxacum polysaccharide was p repared by using taraxacum polysaccharide and sodium selenite as the raw material，accord ing to the synthesis p rincipe of organic selenium compound.The op timal conditions were estab lished by sing le factor and orthogonal design，the content of polysaccharide selenide was determ ined by HPLC，the structure of polysaccharide selenide were characterized by IR and DSC.The results showed that the mass ratio of taraxacum polysaccharide to sodium selenite was 1∶1.2，the volume frac tion of HNO3was 0.3%，the reaction temperature was 70℃ and the reaction time was 8 hours. Under the cond itions，the average contentof selenium in taraxacum polysaccharide was 3.79mg/g and average yield was 33.58%.Infrared Spectrum showed that the selenide taraxacum polysaccharide contained Se=O and Se-C，the selenization of taraxacum polysaccharide was realized，which p rovide a good cond ition for further development and utilization.

taraxacum polysaccharide；sod ium selenite；p reparation；characterization

TS241

B

1002-0306（2014）18-0276-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.053

2013－12－06 *通讯联系人

葛明明（1986-），女，在读研究生，研究方向：生物药物分析。

佳木斯大学研究生创新课题（YJSCX2012-032JD）；黑龙江省卫生厅资助项目（2012-258）。