盐水鸭中耐压菌的分离鉴定及特性研究

冯郁蔺，王虎虎，叶可萍，徐幸莲，刘登勇，周光宏，*

（1.南京农业大学肉品加工与质量控制教育部重点实验室，江苏南京210095；2.渤海大学食品科学研究院，辽宁锦州121013）

盐水鸭中耐压菌的分离鉴定及特性研究

冯郁蔺1，王虎虎1，叶可萍1，徐幸莲1，刘登勇2，*，周光宏1，*

（1.南京农业大学肉品加工与质量控制教育部重点实验室，江苏南京210095；2.渤海大学食品科学研究院，辽宁锦州121013）

以确定盐水鸭中耐压菌的种类，及其致腐能力、耐盐能力和在不同温度下的生长情况等基础特性为研究目的。采用400MPa（20℃、10min）处理盐水鸭胸肉，25℃贮藏，以菌落总数判定其货架期长短。利用传统微生物学方法分离样品中存在的耐压菌，通过菌落形态、革兰氏染色、细菌形态及Vitek 2系统鉴定耐压菌种类。同时，研究耐压菌的致腐能力及在不同NaCl浓度和温度条件下的生长情况，探讨其基础特性。结果表明，超高压400MPa（20℃、10min）杀菌处理可以有效抑制盐水鸭中的细菌，并延长其货架期。盐水鸭中耐压菌包括沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌和蜡状芽孢杆菌。其中，蜡状芽孢杆菌的致腐能力较强，粪肠球菌产酸能力较强。4种耐压菌在NaCl浓度低于7%条件下均可以较好的生长，均在35℃表现出最强的生长能力。

超高压，盐水鸭，耐压菌，致腐特性

盐水鸭是我国特有的低温肉制品，历史悠久，颜色洁白、组织细嫩、口感滑润、风味独特，深受消费者喜爱[1]。盐水鸭传统加工过程中，蒸煮温度较低，加上蒸煮之后的冷却、包装等程序中的二次污染难以控制，导致大量细菌残留。产品中残留细菌在适宜条件下生长繁殖，使得盐水鸭货架期较短，严重制约了其产业的发展。目前，行业内主要采用传统高温处理方法作为二次杀菌，以此延长盐水鸭的货架期。但是由高温杀菌引起的汁液渗出、营养成分的损失及风味的变化[2]，已不被追求高营养价值及高食用品质的消费者所接受，极大地影响了其市场的销售。因此，不改变产品原有感官品质、营养价值及风味的杀菌技术成为研究热点。

近年来，被誉为“20世纪的十大科技之一”的超高压杀菌技术，在日本、欧洲各国及美国引起广泛关注，取得了诸多成果[3]。超高压杀菌技术以其优质的感官可接受性和微生物安全性备受青睐[4]。超高压杀菌技术通过对微生物的抑制和钝化作用延长产品的货架期，导致肉制品中原有微生物种群结构改变[5]。超高压处理后，产品中存在的耐压菌成为贮藏期间的优势微生物，主导产品的安全性及货架期长短。因此，确定超高压处理后产品中的耐压菌种类及其致腐特性是超高压实际应用中保证产品微生物安全性和质量的关键。

鉴于此，本实验使用超高压杀菌技术（400MPa、20℃、10min）处理盐水鸭，通过传统微生物方法分离、鉴定盐水鸭中的耐压菌，并研究其致腐能力、耐盐能力和在不同温度下的生长情况，为超高压杀菌技术在盐水鸭行业的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

盐水鸭 南京某盐水鸭生产线；PCA平板计数琼脂、LB液体培养基 北京陆桥有限公司；GN/GP/BCL细菌鉴定卡 法国梅里埃公司；生理生化鉴定所用培养基（产氨、产H2S、葡萄糖发酵） 购于北京陆桥有限公司；蛋白酶、脂肪酶的制备方法见参考文献[6]。

S-IL-100-850-9-W超高压设备 Stansted Fluid Power Ltd.，Stansted，UK；MultitronⅡ INFORS恒温振荡培养箱 LDX-50KBS；生物安全柜 The Baker Company；均质拍打机 法国Interscience公司；Vitek 2微生物鉴定及药敏分析系统 法国梅里埃公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备及贮藏 盐水鸭购于南京某盐水鸭生产线，样品不经二次杀菌及不添加任何保鲜防腐剂，用无菌取样袋包装，置于冰盒中于1h内送至实验室，在无菌环境下分割鸭胸肉为研究对象，真空包装后备用。

将真空包装后的样品分成2组，一组为对照组，一组为处理组，超高压处理条件为：400MPa、室温（20℃）、10min。超高压处理后样品及对照组样品贮藏于25℃，根据实验要求于0（各组初始菌落总数），1、2、3、4、5、6、7d分别取样，每组3个重复，进行菌落总数的测定及单菌落的分离、纯化。

1.2.2 菌落总数 无菌取25g样品，稀释于装有225m L、0.85%的无菌生理盐水的拍打袋中，以8次/s的速率均质拍打1m in，取1m L上清液依次进行10倍递增稀释，选3个合适的稀释度，每个稀释度做2个平行，按照《GB 4789.2-2010食品微生物学检验菌落总数测定》[7]进行测定。

1.2.3 耐压菌的分离及纯化 计数完毕，于400MPa处理组的不同贮藏期检测培养基中，挑选菌落数在30～300个的平板，从中无菌挑取形态差异不同的菌落，平板划线法反复进行分离、纯化（3次），得到纯菌，观察其菌落形态，进行革兰氏染色判断其阳性或阴性，并观察菌株个体形态。获得的纯种细菌-2℃条件下保存在含有70%的LB液体培养基和30%的灭菌甘油溶液中，待菌种鉴定。

1.2.4 耐压菌的鉴定 取培养24h的单一菌落，置于装有0.45%生理盐水的试管中，用标准比浊计测菌液浓度，最终配制成0.5～0.7（芽孢杆菌为2）麦氏单位的菌悬液。将试管放到样品架上，依据革兰氏染色结果，选择阳性、阴性细菌或芽孢杆菌鉴定卡，将测试卡放在载卡架上，输样管浸入装有待测菌液的标准管中。将载卡架放入仪器的填充仓，扫描卡片信息结束后，取出载卡架并放入装载仓。自动进行封口和上卡，进行生化鉴定。

1.2.5 致腐特性的测定

1.2.5.1 产粘 将分离得到的细菌菌株分别接种于营养琼脂培养基，37℃培养24h，接种环挑取菌落判断其粘性。

1.2.5.2 产氨 将分离得到的细菌菌株分别接种于产氨培养基中，37℃培养24h，滴加3～5滴氨试剂，观察沉淀生成情况，产生黄色或棕红色沉淀者为阳性，否则为阴性，3个重复。

1.2.5.3 产H2S 将分离得到的细菌将分离得到的细菌菌株分别穿刺接种于H2S培养基中，37℃培养2d，沿穿刺线产生黑色沉淀的为阳性，否则为阴性，3个重复。1.2.5.4 产酸 将分离得到的细菌菌株分别接种于液体培养基，37℃培养24h，测定其pH，5个重复。

1.2.5.5 产气 将分离得到的细菌菌株分别接种于葡萄糖发酵培养基中，37℃培养24h，杜氏小管内有气泡产生者为阳性，否则为阴性，3个重复。

1.2.5.6 蛋白酶活力的测定 将分离得到的细菌菌株分别接种于LB液体培养基中，37℃培养24h，8000×g离心5min，收集菌体沉淀，用无菌生理盐水清洗两次，再以无菌生理盐水制成菌液。取0.05m L菌液涂布于酪蛋白培养基上，37℃培养5d，于菌落周围滴加10%（v/v）三氯乙酸，观察菌落周围是否出现透明圈并测其直径d（d＜0.1cm为产酶能力弱，0.1cm＜d＜0.5cm为产酶能力中等，d＞0.5cm为产酶能力强），3个重复。

1.2.5.7 菌株脂肪酶活力测定 将分离得到的细菌菌株分别接种于LB液体培养基中，37℃培养24h，8000×g离心5m in，收集菌体沉淀，用无菌生理盐水清洗两次，再以无菌生理盐水制成菌液。取0.05m L菌液涂布于猪背脂培养基上，37℃培养5d，观察菌落周围是否出现透明圈并测其直径d（d＜0.1cm为产酶能力弱，0.1cm＜d＜0.5cm为产酶能力中等，d＞0.5cm为产酶能力强），3个重复。

1.2.6 耐盐特性 将分离得到的细菌菌株分别接种于NaCl浓度为1%、4%、7%、10%、13%和16%（w/v）的液体培养基中，37℃培养24h，测其OD600值，以未接菌株的培养基作为空白对照，3个重复。

1.2.7 不同温度条件下的生长 将分离得到的细菌菌株接种于LB液体培养基中，分别在4、15、25、35、45、55℃培养24h，测其OD600值，均以未接菌株的培养基作为空白对照，3个重复。

1.3 数据处理

数据统计采用SPSS 18.0进行ANOVA单因素方差分析及Ducan’s多重比较（p＜0.05）；图形制作使用Origin 9.0。

2 结果与讨论

2.1 菌落总数的变化

超高压处理组及对照组样品在25℃贮藏过程中菌落总数的变化如图1所示。样品的初始菌数在2.80lg CFU/g，超高压处理后，菌落总数未能检出，说明超高压对微生物抑制效应较为明显。在贮藏前期，超高压处理后存活的耐压菌受到抑制难以检测，因此处理组样品中的细菌表现为一段时间的迟滞生长。随着贮藏时间的延长，处于受伤状态的耐压菌利用肉制品的营养基质进行修复，快速增长，在第4d超过盐水鸭可接受的最大菌落总数值（4.9lg CFU/g），到达货架期终点。对照组样品在第2d超过4.9lg CFU/g，到达货架期终点。

表1 分离菌株的菌落特征和细菌个体形态Table 1 Characteristics of Community and Morphology of Isolation Strains

图1 各组样品在25°C贮藏过程中菌落总数的变化Fig.1 Microbial growth of different samples during storage at25℃

由菌落总数的变化可以得出，400MPa的杀菌处理能够有效地抑制细菌的生长，并延长盐水鸭胸肉的货架期。这与众多研究[8-10]表明超高压可以显著延长肉制品的货架期结果一致。但是，400MPa杀菌处理后，细菌表现出的迟滞期较短，之后迅速增长，这可能与贮藏温度（25℃）有关，研究证实超高压受伤细菌在适宜的温度下，2～4h即可修复[11]。Linton等[12]研究表明500MPa处理的鸡肉产品在贮藏182d时菌落总数仍未发生显著性变化。因此，不同贮藏温度对超高压的抑菌效果有较大影响，本实验中的25℃适宜细菌生长，受伤的耐压菌迅速恢复其生长繁殖能力，导致贮藏后期产品中菌落总数快速增长。

2.2 菌株的菌落特征和细菌个体形态

400MPa处理盐水鸭胸肉在25℃贮藏过程中，从PCA培养基上具有典型的菌落共挑选出35株纯菌株，经反复进行形态学观察和比较，最后确定4株在菌落形态或细菌个体形态上有差异的纯菌株。分离菌株的菌落特征、细菌个体形态及革兰氏染色结果见表1。

2.3 耐压菌的生化鉴定

分离菌株通过Vitek2微生物自动鉴定系统鉴定，结果见表2。其中，沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）及粪肠球菌（Enterococcus faecalis）鉴定结果相似性分别达到98%、99%和97%，准确性高。由于芽孢杆菌属中的蜡状芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的形态特征和生理生化特征非常相似[13]，Vitek2鉴定结果为相似细菌，因此，采用补充实验加以区分。通过是否存在伴孢晶体及根状菌落的形态区分上述三种细菌，补充实验结果表明分离得到的纯菌为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）。

表2 耐压菌Vitek2鉴定结果Table 2 Identification results of pressure-resistantbacteria by VITEKⅡsystem

由鉴定结果可知，沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌和芽孢杆菌是超高压（400MPa）处理后盐水鸭中主要的存活细菌，即盐水鸭胸肉中的耐压菌。4种耐压菌均为革兰氏阳性菌，与近年来研究表明革兰氏阳性细菌对压力表现出一定的耐受性结果一致[14]。葡萄球菌是禽类及加工环境中常存在的细菌，也有研究表明其具有较好的耐压特性[15]。粪肠球菌存在许多肉制品中，能够在高盐、低水分活度条件下生长，并且对超高压表现出很强的抵抗作用[16]。芽孢杆菌被证实是对超高压具有抵抗力最强的细菌种类，对蜡状芽孢杆菌抑制作用也是超高压杀菌技术中较难解决的问题之一[17]。

2.4 致腐能力

盐水鸭胸肉中耐压菌的致腐特性见表3。4种耐压菌均不产气，均具有产氨的能力，产酸能力测定中空白培养基的pH为6.98，接种4种耐压菌的液体培养基pH均低于6.98，说明4种耐压菌均具有产酸能力。接种粪肠球菌液体培养基的pH为6.12，说明产酸能力在4种耐压菌中最强，但是其产酪蛋白酶和脂肪酶的能力相对较弱，对肉制品中的蛋白质的分解利用程度较低，致腐能力较弱。蜡状芽孢杆菌产酸能力相对较弱，产粘、产酪蛋白酶及脂肪酶的能力相对较强，这与Valerie等[18]对蜡状芽孢杆菌分泌蛋白酶和脂肪酶能力的研究结果基本相同。蛋白酶的分泌可以引起蛋白质分解，造成肉制品腐败变质；脂肪在细菌分泌的脂肪酶作用下，发生水解，导致肉制品酸败变质。同时，蜡状芽孢杆菌产H2S，可能会使产品产生异味。因此，蜡状芽孢杆菌的致腐能力较强。

表3 耐压菌的腐败特性Table 3 Spoilage characteristics of pressure-resistantbacteria

2.5 耐盐特性

盐水鸭胸肉中耐压菌在不同NaCl浓度条件下的生长情况如图2所示。结果表明，耐压菌的生长量均随NaCl浓度的增加而降低，4种耐压菌在NaCl浓度小于7%均有很好的生长能力。在10%NaCl浓度液体培养基中，沃氏葡萄球菌的OD600值在0.14，仍存在生长，其他3种耐压菌的OD600值均小于0.05，生长很弱。NaCl浓度大于13%时，4种耐压菌的OD600值分别为0.019、0.006、0.015和0.013，几乎没有生长能力。

图2 耐压菌在不同NaCl浓度条件下生长情况Fig.2 Effect of NaCl concentrations on the growth ofpressure-resistantbacteria

综上可知，4种耐压菌均有较好的耐盐能力，其中沃氏葡萄球菌的耐盐能力在4种耐压菌中最强，与研究表明葡萄球菌具有较高的耐盐特性的结果一致[19]。同样，粪肠球菌可以在6.5%NaCl浓度下生长也被证实[20]。由于盐水鸭的含盐量为4.0%左右，因此在盐水鸭胸肉中4种耐压菌都能正常生长。

2.6 不同温度条件下的生长情况

盐水鸭胸肉中耐压菌在不同温度条件下的生长情况如图3所示。可以得出，4种耐压菌在4℃和15℃条件下，生长能力很弱；随着温度的升高，4种菌生长能力逐渐增强，在35℃时到达最佳生长状态；在45℃时，4种耐压菌生长能力减弱；在55℃时，基本不生长。

综上可知，4种耐压菌均不耐低温及55℃高温，在25～45℃有较好的生长能力，最适宜生长温度均为35℃，此时生长能力最强。这解释了本实验超高压杀菌后样品中细菌迅速增长的原因，即4种耐压菌在贮藏温度条件下（25℃）有很好的生长能力，同时利用样品中的营养价值进行修复，从而快速恢复其生长繁殖能力。这与研究表明超高压受伤菌在适宜的温度下可快速修复受损细胞结果一致[21]。

图3 耐压菌在不同温度条件下生长情况Fig.3 Effectof temperature on the growth of pressure-resistantbacteria

3 结论

超高压（400MPa）杀菌处理可以有效抑制盐水鸭中的细菌，并延长其货架期。盐水鸭中耐压菌包括沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌和蜡状芽孢杆菌。其中，蜡状芽孢杆菌的致腐能力较强，粪肠球菌产酸能力较强。4种耐压菌在7%NaCl浓度条件下均可以较好的生长，在35℃均表现出最强的生长能力。

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Study on identification and basic characteristics of the pressure-resistant bacteria isolated in Nanjing water-boiled salted duck

FENG Yu-lin1，WANG Hu-hu1，YE Ke-ping1，XU Xing-lian1，LIU Deng-yong2，*，ZHOU Guang-hong1，*
（1.Key Laboratory ofMeat Processing and Quality Control，Ministry of Education，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China；2.Food Science Research Institute，BohaiUniversity，Jinzhou 121013，China）

The p ressure-resistant bacteria in Nanjing water-boiled salted duck，and evaluate the spoilage capability，the tolerance to NaCl and grow th at d ifferent tem peratures of the p ressure-resistant bac teria were determ ined.The breast of the duck was treated by 400MPa（20℃，10m in）and stored at 25℃，and the total number of colonies was used to tell the shelf-life.We used culture-dependentmethod to isolate the p ressureresistant bacteria，which were identified by colony morphology，Gram stain，bacterialmorphology and VitekⅡsystem.What’s more，the spoilage capability and the g row th at d ifferent NaCl concentrations and different tem peratures were stud ied.The results showed that high p ressure 400MPa（20℃，10m in）treatment con effectively inhibit the bac teria in the breast and p rolong its shelf life.The p ressure-resistant bacteria inc luded Staphylococcus warneri，Staphylococcus ep iderm id is，Enterococcus faecalis and Bacillus cereus.Among them，Bacillus cereus had potential spoilage capability，and Enterococcus faecalis had acid p roduction capacity. These p ressure-resistant bacteria could grow well at 7%NaCl concentration，and showed the strongest ability to g row at35℃.

high p ressure；Nanjing water-boiled salted duck；p ressure-resistantbacteria；spoilage characteristics

TS201.3

A

1002-0306（2014）18-0167-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.027

2013－12－18 *通讯联系人

冯郁蔺（1988-），女，硕士研究生，研究方向：肉品质量安全控制。

中央高校基本科研业务费专项资金（KYZ201155）；十二五支撑计划（2012BAD28B03）。