超高压处理对草莓汁品质酶和杀菌效果的影响

柳 青，王 丹，马 越，常 彦，张 超，赵晓燕，*

（1.北京市农林科学院蔬菜研究中心、果蔬农产品保鲜与加工北京市重点实验室、农业部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，北京100097；2.北京农业职业学院食品与生物工程系，北京102442；3.山西农业大学食品学院，山西晋中030801）

超高压处理对草莓汁品质酶和杀菌效果的影响

柳 青1，2，3，王 丹1，马 越1，常 彦1，张 超1，赵晓燕1，*

（1.北京市农林科学院蔬菜研究中心、果蔬农产品保鲜与加工北京市重点实验室、农业部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，北京100097；2.北京农业职业学院食品与生物工程系，北京102442；3.山西农业大学食品学院，山西晋中030801）

研究了超高压处理对草莓汁多酚氧化酶、果胶甲酯酶和杀菌效果的影响。结果表明：超高压处理对草莓汁具有良好的杀菌效果，微生物随着压力的增加而显著减小，300MPa，15min处理草莓汁，菌落总数和霉菌酵母菌均符合商业无菌条件；草莓汁中PPO和PME比较耐压，中低压条件下，PPO和PME酶活性被激活，随压力增加和时间延长而增大。而中高压处理后，酶活性显著减小（p＜0.05），600MPa 25min，PPO及PME残余酶活力分别降至74.6%和47.0%。

超高压，多酚氧化酶，果胶甲酯酶，杀菌效果

草莓色泽鲜艳，营养丰富，风味怡人，含丰富的有机酸，维生素、多酚物质及花色苷等。但其属于热敏性水果，传统热加工会导致褐变和异味的产生[1]，采用非热力杀菌技术可能是解决草莓汁品质劣变的有效方法。超高压技术（U ltra High Pressure，UHP）能有效杀死食品中的腐败微生物和抑制酶的活性，而对食品的香气、维生素和色泽等品质无破坏作用[2]，可以较好地保持果蔬汁的新鲜度和固有营养成分[3]，符合消费者对食品安全、营养和风味的要求。作为非热加工技术，超高压技术近年来已经成为国际的研究热点，日本、德国、美国等发达国家已有各类超高压果汁、果酱等产品上市，受到了消费者的青睐。草莓中含有大量的多酚氧化酶（PPO）和果胶甲酯酶（PME），它们是引起果蔬颜色劣变和沉淀的一类重要的内源酶，不仅导致果汁褐变，影响产品外观，而且其催化产物会影响产品的口感和风味[4]，可将其作为果蔬汁品质评价的指标酶。不同来源的酶在超高压处理时其活性的变化差异较大，超高压处理可降低酶的活性，也可能激活酶的活性，这与酶的特性和超高压作用的条件有关[5]。近年来超高压技术对草莓及其制品研究主要集中品质变化影响的研究[6-7]，而关于不同超高压处理条件对草莓汁中PPO和PME的影响报道较少。本文主要研究不同条件超高压处理对草莓汁品质酶和杀菌效果的影响，以期为草莓的深加工提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

草莓 购于北京新发地市场，品种为丰香，挑拣后分装，分装后立即放入-18℃冰箱保存，实验时取出，4℃解冻，待用；果胶 美国Sigma公司；邻苯二酚、聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP） 天津市福晨化学试剂厂；平板计数培养基、孟加拉红培养基 北京国药有限公司。

超高压处理装置 英国STANSTED公司；紫外-可见分光光度计 日本岛津仪器有限公司；3-18型高速冷冻离心机 德国赛多利斯公司；飞利浦打浆机 飞利浦电子有限公司；水浴锅 北京中兴伟业仪器有限公司；高压均质机 意大利Niro Soavi公司；pH计 瑞士梅特勒-托利多公司；真空包装机 北京日上公司等。

1.2 实验方法

1.2.1 草莓汁的制备 速冻草莓挑选色泽均一无损伤的原料去蒂清洗，于-4℃隔夜解冻，打浆后用打浆机破碎，经过滤、均质后，装入已灭菌的聚乙烯塑料袋中，用真空封口机封口制得草莓汁。

1.2.2 超高压处理 将包装好的草莓汁置于超高压装置内，选取200、300、400、500、600MPa，保压时间5、10、15、20、25m in，温度设置为25℃，以未经超高压处理的草莓汁为空白对照组。超高压处理完样品于4℃冰箱保存，尽快完成各项指标检测。

1.2.3 微生物检测 选取菌落总数、霉菌和酵母菌作为微生物检测指标，依据食品微生物学检验菌落总数测定方法（GB4789.2-2010）和霉菌和酵母菌测定方法（GB4789.15-2010）。为保证实验数据准确性，实验结果均为两个平行样的三组重复数据平均值。

1.2.4 PPO酶活的测定 采用李静[8]的方法，略作修改。粗酶液的提取：20m L草莓汁中加入1%聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），混匀，4℃下放置1h，10000×g，4℃条件下离心20min，上清液冷藏备用。底物溶液的配制：用pH 6.5缓冲溶液配制0.05mol/L邻苯二酚溶液。PPO酶活性测定：反应体系为2.1m L 0.05mol/L邻苯二酚溶液，加入0.7m L 4倍稀释的粗酶液，混匀，室温条件下，在410nm下测定其吸光值的变化，测定吸光值随时间的变化曲线，曲线开始时直线部分的斜率代表PPO酶活。残余酶活计算公式：

其中：反应池中，底物与酶液混合后立即在410nm波长下测定吸光度（A）的变化，每隔30s记录一次A值，根据酶学反应动力学曲线最初直线部分的斜率（△A/t）代表PPO酶活力。即1m in内引起吸光度增加0.001所需的酶量为一个酶活单位（以U/m in表示）。

1.2.5 PME酶活的测定 采用Sampedro F的方法[9]。

底物溶液的配制：10g/L果胶溶液用适量蒸馏水溶解，预热至40℃后置于磁力搅拌器上，缓慢加入10g果胶及5.85g NaCl，蒸馏水定容到1000m L，冷藏备用。PME酶活性测定：40m L 10g/L果胶溶液于（30±2）℃水浴锅中恒温水浴。2.0mol/L NaOH迅速调节pH至7.0，用0.05mol/L NaOH迅速调节pH至7.5，加入3m L粗酶液，再用0.01mol/L NaOH迅速调节pH至7.5，记录加入0.01mol/L NaOH的体积，测定溶液pH重新回到7.5的时间，利用时间和体积的变化速率的线性关系表示PME酶活，计算PME残余酶活。残余酶活计算公式：

其中：酶活性均以滴定时间变化与0.01mol/L NaOH溶液的体积变化形成直线的斜率表示。

1.3 数据处理

采用Origin8.5软件制图并用DPS软件进行方差分析，显著性水平为0.05，当p＜0.05时表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 超高压处理对草莓汁杀菌效果的影响

2.1.1 超高压压力对草莓汁菌落总数的影响 草莓汁的初始菌落总数为4.5Lgcfu/m L。实验保压时间设置15min条件下，考察不同超高压压力对草莓汁中菌落总数的影响。由图1可知升高压力使草莓汁中菌落总数迅速降低。300MPa下残存菌落数降至1.5Lgcfu/m L，在此基础上继续提高压力（≥300MPa）均可使果汁达到商业无菌标准要求（小于100cfu/m L）。而200MPa下菌落总数虽然显著降低了1.9个对数值（p＜0.05），但超过了果汁国家标准要求；随着压力的增加，菌落总数持续下降，但其差异并不明显。这是因为每种菌都有耐压阈值，压力敏感菌压力阈值较低，而耐压菌的阈值较高。低压条件下，一部分对压力敏感的细菌迅速被杀灭，而耐压菌具有较强的耐压性，600MPa时菌落总数显著降低（p＜0.05）。与黄丽[10]研究结果类似，当压力升到200MPa，荔枝汁中的菌落总数迅速下降，降低至170cfu/m L，400MPa时达到商业无菌条件，当压力大于500MPa时，杀菌效果提高不显著。

图1 超高压压力对草莓汁中菌落总数的影响Fig.1 Effectof pressure treatment on total bacterial count in strawberry juice

2.1.2 超高压压力对草莓汁霉菌和酵母菌的影响霉菌和酵母菌容易引起果蔬腐败变质，一些霉菌会产生毒素，进而影响果汁的饮用安全。实验保压时间设置15m in条件下，考察不同超高压压力对草莓汁中霉菌和酵母菌的影响。由图2可知，草莓汁初始霉菌和酵母菌数为4.4Lgcfu/m L。霉菌及酵母菌对压力很敏感，300MPa下已无霉菌和酵母菌检出。Ogawa等[11]研究了温州蜜橘汁在350～400MPa压力可以将果汁中霉菌和酵母菌的数量降低5个对数级；潘见[7]研究发现草莓汁中霉菌及酵母菌在350MPa，5m in处理后，草莓汁中的霉菌和酵母菌总数为10cfu/m L，继续延长保压时间到10m in后，样品中检测不到霉菌和酵母菌。

图2 超高压压力对草莓汁霉菌和酵母菌的影响Fig.2 Effectof pressure treatment onmold and yeast count in strawberry juice

2.1.3 保压时间对草莓汁菌落总数的影响 由图3可知，300MPa下保压5m in之内，细菌存活量下降速率大；随着保压时间延长，曲线逐渐平缓，细菌存活量下降速率明显减弱。可能由于一部分耐压力弱的微生物迅速死亡，而随着处理时间的延长，部分耐压菌仍然可以存活。当细菌残留率达到一定值后，单纯的增加超高压处理时间，杀菌效果并不明显，需要结合其他的处理方式如协同温度、脉冲加压等方式可进一步提高杀菌效果。Baymdirli等[12]研究发现350MPa协同40℃条件下处理苹果柑橘汁5m in可全部杀灭果汁中的微生物。

图3 保压时间对草莓汁中菌落总数的影响Fig.3 Effect of UHP treatment time on total bacterial count in strawberry juice

2.1.4 保压时间对草莓汁霉菌和酵母菌的影响 由图4可知，300MPa保压时间为5m in，草莓汁中霉菌和酵母菌全部杀灭，相比细菌，霉菌和酵母菌对压力更为敏感。刘野[13]研究超高压对鲜榨西瓜汁杀菌效果结果表明，600MPa下，0～15m in范围内，霉菌和酵母菌数迅速降低至10cfu/m L，而后随着处理时间的延长保持不变，当达到60m in时霉菌和酵母菌数降为2cfu/m L。

图4 保压时间对草莓汁中霉菌和酵母菌数量的影响Fig.4 Effect of UHP treatment time onmold and yeast count in strawberry juice

2.2 超高压处理对草莓汁PPO活性的影响

2.2.1 超高压压力对草莓汁PPO活性的影响 由图5可知，不同超高压压力处理草莓汁的PPO酶活性整体呈降低趋势。400、500、600MPa，处理15m in，PPO残余酶活力分别降至83.96%、78.78%、80.67%，处理压力在PPO的钝化效果上起主要作用，且PPO酶出现钝化和激活两种现象。200、300MPa分别处理5m in，200MPa处理10min，PPO活性较空白对照组（100%）显著升高（p＜0.05），分别增加了15.52%、4.31%、2.64%，低压短时处理草莓汁，使酶从草莓汁细胞碎片附着而被束缚的状态中解离出来，先游离出来的部分酶变性失活，使PPO酶活性升高[14]；宋丹丹[15]研究胡萝卜草莓复合汁中酶和微生物的影响时也发现，PPO在200MPa下被激活，酶活提高24%，300、400MPa时分别失活12%、36%，500MPa时略有回升。

图5 超高压压力对草莓汁PPO酶活性的影响Fig.5 Effectof pressure treatmenton PPO activity in strawberry juice

2.2.2 保压时间对草莓汁PPO活性的影响 果蔬加工需抑制或钝化酶的活性以保证产品质量。PPO和PME易引起酶促褐变，导致果汁沉淀，从而影响草莓汁的品质。由图6可知，随保压时间延长，草莓汁的PPO酶活性整体呈降低趋势。400～600MPa，15～25m in条件下，PPO酶活性降低程度较小，600MPa，25min处理PPO残余酶活力为74.6%。因此，保压时间并非越长越好，继续延长处理时间，酶活变化不显著。与前人对辣椒、荔枝、鳄梨等来源的酶耐压性相比，草莓汁中PPO仍具有较高的相对活性，可能与草莓的品种及存在的介质、体系pH相关[16]，草莓对压力的耐受能力较强而不易被钝化。有研究表明，当压力在200～600MPa、温度为60℃，处理10～20m in能将新鲜荔枝PPO的相对活性降到20%以下，但荔枝果酱PPO的相对活性仍保持在40%～60%[17]。

图6 保压时间对草莓汁PPO酶活性的影响Fig.6 Effectof UHP treatment time on PPO activity in strawberry juice

2.3 超高压处理对草莓汁PME酶活性的影响

图7 超高压压力对草莓汁PME酶活性的影响Fig.7 Effectof t pressure treatmenton PME activity in strawberry juice

2.3.1 超高压压力对草莓汁PME酶活性的影响 PME酶与果汁的稳定性和果蔬质地密切相关。PME酶耐压性较强。由图7可知，不同超高压压力处理草莓汁的PME酶活性并未呈现明显的规律，分别出现激活和降低两种现象。600MPa下处理草莓汁25m in，PME酶活下降幅度较大，降至47.0%；200MPa，5min，PME活性较空白对照组增加了9.9%（p＜0.05）；400MPa处理草莓汁5m in，PME酶被激活，显著升高了8.0%（p＜0.05）。Cano等[18]研究超高压对橙汁中PME的钝化效果时发现，20～25℃下，200～400MPa处理橙汁，使PME出现不同程度的激活现象，且随着压力增加PME活性变化很小。较低压力下能展开蛋白质链，改变酶的三维构造，暴露活性位点，但此变化一般是可逆的。而在较高压力下酶的三维构象发生不可逆分解，所以存在酶激活的现象。一般情况下，超高压处理时，压缩的能量将提高食品的温度，每增加100MPa压力，温度大约升高2～3℃，这取决于食品原料的成分。本实验中，超高压设备具有控温设施，可根据实验需要设置处理温度，且当样品袋浸没于高压容器传压油中，升压和卸压时间很短，在1～2s即可完成升压和卸压过程，可以保持样品温度在保压过程中不会发生较大波动。

2.3.2 保压时间对草莓汁PME酶活性的影响 由图8可知，随着保压时间的延长，草莓汁的PME酶活性整体呈降低趋势。低压短时处理，PME酶活性未发生显著变化。200～500MPa，延长保压时间，PME酶活性降低不明显；600MPa，15m in条件下，PME酶活性降至84.0%，在此基础上增加保压时间PME酶被急剧钝化，失活程度加深。PME在较低压力条件下活性上升，只有当压力达到一定程度时，酶活性才有所减少[19]。陈贺庆等[16]研究超高压对橙汁中PME活性的影响，结果表明随着处理时间延长，高压条件下，PME残留活性显著下降，600MPa、20m in处理橙汁残留酶活性达17.41%。保压时间并非越长越好，PPO和LOX在10m in POD在15m in时分别失活最大，继续延长处理时间酶活变化不显著。

图8 保压时间对草莓汁PME酶活性的影响Fig.8 Effect of UHP treatment time on PME activity in strawberry juice

3 结论

3.1 超高压处理对草莓汁具有良好的杀菌效果。草莓汁中微生物随着压力的增加而显著减小，细菌比霉菌、酵母菌耐压，延长处理时间对草莓汁杀菌效果不显著。300MPa，15m in以后，草莓汁中菌落总数和霉菌酵母菌数均符合商业无菌条件。

3.2 升高压力增强草莓汁PPO和PME酶的钝化效果，进一步延长保压时间PPO酶活性降低不明显。低压短时间处理草莓汁，200、300MPa，5m in和200MPa，10m in，PPO活力较空白对照组分别提高了15.52%、4.31%和2.64%（p＜0.05）；中高压处理后，PPO酶活性显著减小，600MPa，25min，PPO残余酶活力降至74.6%。200MPa下，处理5m in对PME酶有激活现象；600MPa，25min时，PME活性显著减小（p＜0.05），残余酶活力降至47.0%。

3.3 草莓汁中PPO和PME比较耐压，仅增加压力与处理时间并不能使酶完全失活，还需结合其他因素的作用，如协同温度、加压方式以及协调食品中糖、酸、脂肪、蛋白质和可溶性盐等的介质影响，以此达到更好的杀菌钝酶效果。

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Effectof high hydrostatic pressure processing of quality enzyme and sterilization in strawberry juice

LIU Qing1，2，3，WANG Dan1，MA Yue1，CHANG Yan1，ZHANG Chao1，ZHAO Xiao-yan1，*
（1.Beijing Vegetable Research Center，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing Key Laboratory of Agricultural Products of Fruits and Vegetables Preservation and Processing，Key Laboratory of Biology and Genetic Improvementof Horticulture Crops（North China），Ministry of Agriculture，Beijing 100097，China；2.Food and Bioengineering Department，Beijing Vocational College of Agriculture，Beijing 102442，China；3.College of Food Science，Shanxi Agricultural University，Jinzhong 030801，China）

The effect of high p ressure treatment on polyphenol oxidase，pectinesterase and sterilization in strawberry juice were investigated.The results showed that：high p ressure treatment had good effec t on sterilization，m icrobial decreases significantly w ith the increase of p ressure.300MPa，15m in，total bacterial count and mold yeast count in strawberry juice were in accordance w ith commercial asep tic cond itions.PPO and PME were resistance to p ressure，on low p ressure cond ition，the activity of PPO and PME were activated which increased w ith p ressure and time.Well，the enzyme activity was significantly decreased（p＜0.05）on high p ressure.600MPa，25m in，PPO and PME residualenzyme activity d ropped to 74.6%and 47.0%respectively.

high hyd rostatic p ressure；polyphenoloxidase；pectin methylesterase sterilization

TS255.1

A

1002-0306（2014）18-0144-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.022

2013－11－11 *通讯联系人

柳青（1982-），女，博士，讲师，研究方向：食品营养与检测。

现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-25）；北京市农林科学院科技创新能力建设专项（KJCX201102002）。