豆甾二烯用于特级初榨橄榄油掺假检测的研究

张 欣，杨瑞钰，陈 迪，方晓明，*，丁卓平，*

（1.上海海洋大学食品学院，上海201306；2.上海市标准化研究院，上海200031；3.上海出入境检验检疫局，上海200135）

豆甾二烯用于特级初榨橄榄油掺假检测的研究

张 欣1，杨瑞钰2，陈 迪3，方晓明3，*，丁卓平1，*

（1.上海海洋大学食品学院，上海201306；2.上海市标准化研究院，上海200031；3.上海出入境检验检疫局，上海200135）

研究了利用豆甾二烯进行特级初榨橄榄油的掺假检测，考察了在特级初榨橄榄油中掺入不同比例油橄榄果渣油、榛子油、葵花籽油、大豆油、玉米油、花生油、米糠油、棕榈油和核桃油，采用高效液相色谱法（HPLC）测定掺和油中的3，5-豆甾二烯含量。植物油样品用石油醚溶解，过硅胶柱净化，C30柱分离，乙腈/叔丁基甲醚（75∶25，V/V）作流动相，紫外检测波长235nm。结果表明，本方法具有良好的回收率及精密度，3，5-豆甾二烯是特级初榨橄榄油掺假鉴别的一个十分重要的特征性指标，本方法能够鉴别出了特级初榨橄榄油中掺入0.3%油橄榄果渣油、0.5%榛子油、2.1%葵花籽油、0.5%大豆油、0.3%玉米油、1.5%花生油、0.2%米糠油、0.6%棕榈油和0.6%核桃油。

3，5-豆甾二烯，特级初榨橄榄油，高效液相色谱法，掺假

橄榄油是橄榄树果实的汁液，是唯一从新鲜果子中提取的食用油，也是世界上唯一以自然状态的形式供人类食用的木本植物油[1-2]。其中具有最高营养品质的特级初榨橄榄油是市场上销售的主要橄榄油品种。但随着橄榄油日益受到人们的青睐，掺杂使假情景比比皆是。这些掺入的植物油脂不但便宜而且有些油脂用先进的检测手段也比较难发现。目前橄榄油的掺假鉴别以光谱法（如：荧光光谱法[3]，红外光谱法[4-6]、拉曼光谱法[7]等）和色谱法为主。一般而言，光谱法需要化学计量学的方法（如：主成分分析、聚类分析等）对谱图进行分析后才能得出结果。而色谱法通过分析橄榄油中特征性物质组成和含量，来判断特级初榨橄榄油是否掺入其他植物油。这些特征性物质包括脂肪酸[8-9]、角鲨烯[10]、游离生育酚[11]、非蛋白质氨基酸（鸟氨酸，异亮氨酸）[12]、蜡含量[13]、极性化合物[14]、挥发性物质[15]等。鲜有报道以甾醇烯作为特征性指标应用于橄榄油掺假鉴别研究。甾醇烯类物质是油在脱色、水蒸气洗涤以及除臭等精炼过程中，油脂中的甾醇易发生脱水反应，产生烯键，形成的具有共轭双键的物质[16-18]。在植物油精练过程中，以β-谷甾醇脱水产生的3，5-豆甾二烯含量最为丰富。本文研究了豆甾二烯用于特级初榨橄榄油掺假检测，考察了特级初榨橄榄油中掺入不同比例其他植物油的掺合油后其3，5-豆甾二烯的含量。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

不同品牌植物油 均来自上海出入境检验检疫局，具体见表1；3，5-菜甾二烯和3，5-豆甾二烯混合溶液 挪威Chiron AS公司，100mg/L（19∶81，V/V），纯度＞99.0%；石油醚、乙腈 色谱纯；加拿大Caledon公司；正己烷 色谱纯，美国J.T.Baker公司；叔丁基甲醚（色谱纯） 美国Sigma公司；无水硫酸钠 分析纯，国药集团化学试剂有限公司，于500℃烘4h以上，冷却后储存于干燥器中备用；硅胶60 德国Merck公司（0.063～0.200mm），于450℃烘5h以上，冷却后加入2%水，混匀，转移至广口试剂瓶中，盖塞备用；水 超纯水。

2695型高效液相色谱仪、2487型紫外检测器美国Waters公司；N-EVAP111型氮吹仪 美国Organomation公司；硅胶柱 国药集团化学试剂有限公司，为带活塞的砂芯玻璃层析柱（ø10mm×250mm），加入30m L石油醚于柱中，加7.5g硅胶，静置片刻，待硅胶沉积后，顶端再加0.5cm无水硫酸钠，打开活塞，石油醚缓慢淋洗下来至高出顶端无水硫酸钠约0.5mm，关闭活塞。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制 用正己烷配制3，5-豆甾二烯标准溶液，再用其稀释至所需浓度，保存在-18℃条件下。

1.2.2 样品处理 称取植物油样品1.0g（精确至0.01g）于烧杯中，加入5m L石油醚，混匀，倒入硅胶柱中，用5m L石油醚润洗烧杯2次，一并倒入柱中。当石油醚液面与上端无水硫酸钠层相切时，加入30m L石油醚，收集全部洗脱液至50m L收集管中，于45℃水浴中以氮气吹至干，用正己烷定容至1.0m L，待测。若样液浓度超出线性范围，则稀释一定倍数，使之在线性范围内。

1.2.3 液相色谱条件 C30色谱柱（250mm×4.6mm i.d，5μm，YMC公司），柱温25℃；乙腈/叔丁基甲醚（75∶25，V/V）作流动相等度洗脱，流速1.0m L/m in；紫外检测波长235nm；进样量20μL。

2 结果与讨论

2.1 方法评价与有效性验证

为考察方法有效性，进行加标回收实验。由于特级初榨橄榄油不含待测物或含量在本方法检出限之下，故选择其作为添加回收实验的样品。样品的添加水平分别为0.05、0.10、0.50mg/kg，每个水平重复8次，样品回收率及精密度见表2。由表2可见，加标样品的平均回收率在96.3%～102.3%之间；相对标准偏差RSD＜4.6%（n=8）。结果表明，本方法对3，5-豆甾二烯的测定具有良好的准确度和精密度。

表1 各种植物油品牌及产地Table 1 Brand and origin of different kinds of vegetable oils

表2 添加样品回收率及精密度（n=8）Table 2 The recovery and precision of spiked samples（n=8）

根据3倍和10倍信噪比（S/N）确定检出限和测定低限，3，5-豆甾二烯的检出限为0.015mg/kg，测定低限为0.05mg/kg。

3，5-豆甾二烯标准品色谱图见图1。

图1 3，5-豆甾二烯标准品色谱图Fig.1 Chromatogram of stigmasta-3，5-diene

2.2 各种植物油3，5-豆甾二烯本底值的测定

取不同产地不同品牌植物油。其中，特级初榨橄榄油5个品种，油橄榄果渣油5个品种，榛子油3个品种，葵花籽油5个品种，大豆油3个品种，玉米油3个品种，花生油3个品种，米糠油3个品种，棕榈油3个品种，核桃油3个品种，分别测定其3，5-豆甾二烯含量，每个实验均重复3次，所得结果见表3。由表3可见，不同种类植物油3，5-豆甾二烯含量相差较大，特级初榨橄榄油与其他种类植物油中3，5-豆甾二烯存在巨大差异。虽然我国GB23347-2009《橄榄油、油橄榄果渣油》中规定初榨橄榄油中3，5-豆甾二烯限量标准为≤0.15mg/kg，但其在特级初榨橄榄油中几乎检测不到。除特级初榨橄榄油，冷榨的葵花籽油和花生油以外，其他经过热处理生产的植物油3，5-豆甾二烯含量较高。油橄榄果渣油中虽然含有一定比例的特级初榨橄榄油，但其3，5-豆甾二烯含量较高。玉米油含有较高3，5-豆甾二烯，除了与加工方式相关外，其本身含有的大量植物甾醇也是其3，5-豆甾二烯含量高的原因。图2为代表性样品（特级初榨橄榄油、油橄榄果渣油、榛子油和葵花籽油）的3，5-豆甾二烯色谱图。

2.3 3，5-豆甾二烯用于特级初榨橄榄油掺假的鉴别

本文分别考察了特级初榨橄榄油掺入油橄榄果渣油、榛子油、葵花籽油、大豆油、玉米油、花生油、米糠油、棕榈油和核桃油的混合油中3，5-豆甾二烯含量。根据GB23347-2009中对初榨橄榄油3，5-豆甾二烯的限量标准，结合表3测得的各植物油中的3，5-豆甾二烯含量，对特级初榨橄榄油掺入各种植物油的质量分数进行估算，设定特级初榨橄榄油中掺入油橄榄果渣油、榛子油、大豆油、玉米油、棕榈油和核桃油的质量分数为0.2%、0.25%、0.3%、0.5%和1%；掺入葵花籽油和花生油的质量分数为1%、2%、3%、5%和10%；掺入米糠油的质量分数为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%。以特级初榨橄榄油中掺入植物油的质量分数为横坐标，3，5-豆甾二烯含量为纵坐标，进行回归分析，所得各回归方程见表4。由表可见，r2均大于0.99，说明该测定方法十分可靠，随不同质量分数添加，3，5-豆甾二烯含量均呈良好线性，被测物质无其他杂质干扰。将限量标准0.15mg/kg代入回归方程得出各油脂掺入特级初榨橄榄油的最低质量分数，结果见表4。本方法能够鉴别出特级初榨橄榄油中掺入了0.3%油橄榄果渣油、0.5%榛子油、2.1%葵花籽油、0.5%大豆油、0.3%玉米油、1.5%花生油、0.2%米糠油、0.6%棕榈油和0.6%核桃油。相比其他用于特级初榨橄榄油掺假鉴别指标[8，11-12，14-15]，利用3，5-豆甾二烯含量进行检测更为灵敏，掺入植物油的质量分数检出限更低。

图2 代表性样品3，5-豆甾二烯色谱图Fig.2 Stigmasta-3，5-diene chromatograms of representative samples

表3 各种植物油样品中3，5-豆甾二烯测定结果Table 3 Stigmasta-3，5-diene content in vegetable oils

表4 掺入量回归方程Table 4 Regression equation of admixture amount

2.4 实际应用

图3为某执法部门查获的掺假的特级初榨橄榄油豆甾二烯色谱图，检出其3，5-豆甾二烯含量为16.38mg/kg，远高于初榨橄榄油3，5-豆甾二烯≤0.15mg/kg的标准，再一次印证了这一指标的特征性和有效性，可以用于日常特级初榨橄榄油掺假鉴别中。

图3 掺假特级初榨橄榄油色谱图Fig.3 Chromatogram of adulterated extra virgin olive oil

3 结论

本文利用高效液相色谱技术对植物油中3，5-豆甾二烯含量分析方法的准确性和精确度进行了研究，实验证明该方法回收率高，重复性好。3，5-豆甾二烯是特级初榨橄榄油掺假鉴别的重要指标，该指标准确、灵敏、可靠，能够鉴别出特级初榨橄榄油中掺入了0.3%油橄榄果渣油、0.5%榛子油、2.1%葵花籽油、0.5%大豆油、0.3%玉米油、1.5%花生油、0.2%米糠油、0.6%棕榈油和0.6%核桃油。

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Study on stigmastadienes used for extra virgin olive oil adulteration detection

ZHANG Xin1，YANG Rui-yu2，CHEN Di3，FANG Xiao-m ing3，*，DING Zhuo-ping1，*
（1.College of Food Science&Technology，ShanghaiOcean University，Shanghai201306，China；2.Shanghai Institute of Standardization，Shanghai200031，China；3.Shanghai Exit-Entry Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai200135，China）

The stigmastad ienes used for extra virgin olive oiladulteration detection was investigated.Stigmasta-3，5-d iene content of the extra virgin olive oilb lended w ith d ifferent p roportion of olive pomace oil，hazelnut oil，sunflower oil，soybean oil，corn oil，peanut oil，rice b ran oil，palm oil and walnut oil were detected by highperformance liquid chromatography（HPLC）.Vegetab le oil samp les were dissolved w ith petroleum ether，c leaned up with a silica gel column，separated w ith C30column and determ ined by ultraviolet detection at 235nm.Acetonitrile/tert-butylmethyl ether（75∶25，V/V）was served as mobile phase in isocratic elution.The results showed that the method had good recovery and p recision，and stigmasta-3，5-d iene was an im portant characteristic index which could be used for extra virgin olive oil adulteration detection.The p roposed method could reliab ly identify extra virgin olive oilb lended w ith 0.3%olive pomace oil，0.5%hazelnutoil，2.1%sunflower oil，0.5%soybean oil，0.3%corn oil，1.5%peanut oil，0.2%rice b ran oil，0.6%palm oil and 0.6%walnut oil，respectively.

stigmasta-3，5-d iene；extra virgin olive oil；high performance liquid chromatog raphy（HPLC）；adulteration

TS207.3

A

1002-0306（2014）18-0080-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.008

2013－10－10 *通讯联系人

张欣（1988-），女，在读硕士研究生，研究方向：食品安全分析。

国家质检总局科研项目（2012IK184）；上海市技术性贸易措施应对专项项目（12TBT010）。