抗稻瘟病菌活性木荷皂甙类似物的分离条件及其分离

王纯荣等

摘要：新型木荷各皂甙极性相似，结构相近，给分离带来了极大困难，制约了抗稻瘟病菌活性木荷皂甙先导物的确立。运用单因素（色谱柱填料、流速、流动相配比）探索其色谱行为，综合塔板理论、速率理论及线性放大原理推导，以及菌丝生长速率法测定活性，确定了木荷皂甙的色谱分析条件为：Hypersil BDS C18色谱柱，流速0.8 mL/min，特定的梯度洗脱程序，获得了较为满意的色谱分析图谱。

关键词：木荷皂甙； 色谱行为； 分离； 抗稻瘟病菌活性

M2IGR5R2和M2IGR5R3级分抗稻瘟病菌活性较强，所含成分复杂，经酸水解发现仅含一种皂甙元（见图1），各单体之间主要是糖基上的差异。糖基种类、糖基与甙元的连接方式、连接次序、连接位置等微小差异，虽然是同一类皂甙，但结构相近，性质相似， 给分离带来极大困难。本研究探讨难分离木荷皂甙在不同色谱条件下的色谱行为，推导出半经验半制备分离公式，成功分离到多个木荷皂甙单体，确定了木荷抗稻瘟病菌活性皂甙先导物。

2实验部分

2.1仪器、试剂与材料

Agilent1200分析型液相色谱（配备G1311A 四元泵、G1316A 柱温箱、G1314A VWD检测器、G1313A 标准型自动进样器、G1379B 微量真空脱气机）；LC3000中高压制备色谱分离系统（配备P3000高压双泵系统、UV3000紫外可见检测器、 Knauer动态混合器）；分析型色谱柱：Thermo Fisher BDS HYPERSIL C18、Venusil XBP C18、Waters Xbridge C18、Agilent ZORBAX SB C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm），半制备型色谱柱：Thermo Fisher BDS HYPERSIL C18（250 mm ×10 mm， 5 μm）。乙腈、甲醇（色谱纯 国药集团化学试剂有限公司）。木荷皂甙级分M2IGR5R2和 M2IGR5R3由本实验室分离制得。稻瘟病菌，由江西省农业科学院植物保护研究所提供。

2.2色谱条件

2.3抗稻瘟病菌活性测定方法

2.3.1含药培养基的配制采用2倍稀释法配制浓度为20.00， 10.00， 5.00， 2.50， 1.25， 0.63， 0.31和0.0 mg/L的含木荷皂甙培养基各10.00 mL，每个培养基中加0.20 g 琼脂，灭菌备用。

2.3.2毒力方程的绘制菌丝生长速率法[5～7]：将各10.00 mL的培养基对号倒入直径为7 cm的平皿中，待其凝固，用打孔器（Φ 5.00 mm）沿菌落边缘打取菌龄长势一致菌块，在含药培养基及对照中接入3个菌块，28 ℃培养60 h后用游标卡尺十字交叉法测量菌落直径（mm），计算其抑菌率。抑菌率计算公式：T（%）=（R0-R2）/（R0-R1）×100；T为抑菌率，R0为空白菌落直径，R1为接入菌块直径，R2为含药菌落直径。以皂甙含量的对数值对抑菌率绘制毒力方程。

利用7.05版DPS软件处理数据。

摘要：新型木荷各皂甙极性相似，结构相近，给分离带来了极大困难，制约了抗稻瘟病菌活性木荷皂甙先导物的确立。运用单因素（色谱柱填料、流速、流动相配比）探索其色谱行为，综合塔板理论、速率理论及线性放大原理推导，以及菌丝生长速率法测定活性，确定了木荷皂甙的色谱分析条件为：Hypersil BDS C18色谱柱，流速0.8 mL/min，特定的梯度洗脱程序，获得了较为满意的色谱分析图谱。

关键词：木荷皂甙； 色谱行为； 分离； 抗稻瘟病菌活性

M2IGR5R2和M2IGR5R3级分抗稻瘟病菌活性较强，所含成分复杂，经酸水解发现仅含一种皂甙元（见图1），各单体之间主要是糖基上的差异。糖基种类、糖基与甙元的连接方式、连接次序、连接位置等微小差异，虽然是同一类皂甙，但结构相近，性质相似， 给分离带来极大困难。本研究探讨难分离木荷皂甙在不同色谱条件下的色谱行为，推导出半经验半制备分离公式，成功分离到多个木荷皂甙单体，确定了木荷抗稻瘟病菌活性皂甙先导物。

2实验部分

2.1仪器、试剂与材料

Agilent1200分析型液相色谱（配备G1311A 四元泵、G1316A 柱温箱、G1314A VWD检测器、G1313A 标准型自动进样器、G1379B 微量真空脱气机）；LC3000中高压制备色谱分离系统（配备P3000高压双泵系统、UV3000紫外可见检测器、 Knauer动态混合器）；分析型色谱柱：Thermo Fisher BDS HYPERSIL C18、Venusil XBP C18、Waters Xbridge C18、Agilent ZORBAX SB C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm），半制备型色谱柱：Thermo Fisher BDS HYPERSIL C18（250 mm ×10 mm， 5 μm）。乙腈、甲醇（色谱纯 国药集团化学试剂有限公司）。木荷皂甙级分M2IGR5R2和 M2IGR5R3由本实验室分离制得。稻瘟病菌，由江西省农业科学院植物保护研究所提供。

2.2色谱条件

2.3抗稻瘟病菌活性测定方法

2.3.1含药培养基的配制采用2倍稀释法配制浓度为20.00， 10.00， 5.00， 2.50， 1.25， 0.63， 0.31和0.0 mg/L的含木荷皂甙培养基各10.00 mL，每个培养基中加0.20 g 琼脂，灭菌备用。

2.3.2毒力方程的绘制菌丝生长速率法[5～7]：将各10.00 mL的培养基对号倒入直径为7 cm的平皿中，待其凝固，用打孔器（Φ 5.00 mm）沿菌落边缘打取菌龄长势一致菌块，在含药培养基及对照中接入3个菌块，28 ℃培养60 h后用游标卡尺十字交叉法测量菌落直径（mm），计算其抑菌率。抑菌率计算公式：T（%）=（R0-R2）/（R0-R1）×100；T为抑菌率，R0为空白菌落直径，R1为接入菌块直径，R2为含药菌落直径。以皂甙含量的对数值对抑菌率绘制毒力方程。

利用7.05版DPS软件处理数据。

摘要：新型木荷各皂甙极性相似，结构相近，给分离带来了极大困难，制约了抗稻瘟病菌活性木荷皂甙先导物的确立。运用单因素（色谱柱填料、流速、流动相配比）探索其色谱行为，综合塔板理论、速率理论及线性放大原理推导，以及菌丝生长速率法测定活性，确定了木荷皂甙的色谱分析条件为：Hypersil BDS C18色谱柱，流速0.8 mL/min，特定的梯度洗脱程序，获得了较为满意的色谱分析图谱。

关键词：木荷皂甙； 色谱行为； 分离； 抗稻瘟病菌活性

M2IGR5R2和M2IGR5R3级分抗稻瘟病菌活性较强，所含成分复杂，经酸水解发现仅含一种皂甙元（见图1），各单体之间主要是糖基上的差异。糖基种类、糖基与甙元的连接方式、连接次序、连接位置等微小差异，虽然是同一类皂甙，但结构相近，性质相似， 给分离带来极大困难。本研究探讨难分离木荷皂甙在不同色谱条件下的色谱行为，推导出半经验半制备分离公式，成功分离到多个木荷皂甙单体，确定了木荷抗稻瘟病菌活性皂甙先导物。

2实验部分

2.1仪器、试剂与材料

Agilent1200分析型液相色谱（配备G1311A 四元泵、G1316A 柱温箱、G1314A VWD检测器、G1313A 标准型自动进样器、G1379B 微量真空脱气机）；LC3000中高压制备色谱分离系统（配备P3000高压双泵系统、UV3000紫外可见检测器、 Knauer动态混合器）；分析型色谱柱：Thermo Fisher BDS HYPERSIL C18、Venusil XBP C18、Waters Xbridge C18、Agilent ZORBAX SB C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm），半制备型色谱柱：Thermo Fisher BDS HYPERSIL C18（250 mm ×10 mm， 5 μm）。乙腈、甲醇（色谱纯 国药集团化学试剂有限公司）。木荷皂甙级分M2IGR5R2和 M2IGR5R3由本实验室分离制得。稻瘟病菌，由江西省农业科学院植物保护研究所提供。

2.2色谱条件

2.3抗稻瘟病菌活性测定方法

2.3.1含药培养基的配制采用2倍稀释法配制浓度为20.00， 10.00， 5.00， 2.50， 1.25， 0.63， 0.31和0.0 mg/L的含木荷皂甙培养基各10.00 mL，每个培养基中加0.20 g 琼脂，灭菌备用。

2.3.2毒力方程的绘制菌丝生长速率法[5～7]：将各10.00 mL的培养基对号倒入直径为7 cm的平皿中，待其凝固，用打孔器（Φ 5.00 mm）沿菌落边缘打取菌龄长势一致菌块，在含药培养基及对照中接入3个菌块，28 ℃培养60 h后用游标卡尺十字交叉法测量菌落直径（mm），计算其抑菌率。抑菌率计算公式：T（%）=（R0-R2）/（R0-R1）×100；T为抑菌率，R0为空白菌落直径，R1为接入菌块直径，R2为含药菌落直径。以皂甙含量的对数值对抑菌率绘制毒力方程。

利用7.05版DPS软件处理数据。