响应面法优化木瓜蛋白酶提取草鱼鱼鳞胶原蛋白的研究

张璟晶，唐劲松，王海波，力朝洲，冯晓蕊

（江苏农牧科技职业学院食品科技学院，江苏泰州225300）

响应面法优化木瓜蛋白酶提取草鱼鱼鳞胶原蛋白的研究

张璟晶，唐劲松，王海波，力朝洲，冯晓蕊

（江苏农牧科技职业学院食品科技学院，江苏泰州225300）

以草鱼鱼鳞为原料，用木瓜蛋白酶解提取草鱼鱼鳞中的胶原蛋白，并对其性质进行初步研究。在单因素试验的基础上，采用响应面法Box-Behnken试验设计，对影响提取率的酶解温度、加酶量、底物质量分数3个因素进行优化，建立并分析各因素与胶原蛋白提取率关系的数学模型。确定木瓜蛋白酶提取鱼鳞胶原蛋白的最佳条件为酶解温度50℃，加酶量3.5 g/L，底物质量分数22%，经过验证胶原蛋白提取率为15.4%。得到鱼鳞胶原蛋白吸水性接近于甘油，保水性优于甘油，具有一定的乳化性和乳化稳定性。

鱼鳞；胶原蛋白；响应面法；提取；性质研究

我国每年鱼的废弃物总量超过200万t，其中鱼鳞约占15%[1]。鱼鳞中主要成分是蛋白质和羟基磷灰石，而蛋白质组成中又以胶原蛋白为主[2]。据报道，鱼鳞胶原蛋白可制成可食性蛋白膜[3]，用于香肠、糖果、糕点等的制作，还可以作为乳化剂、增稠剂、发泡剂、胶凝剂等添加到肉制品等产品中[4]，水解得到的鱼鳞胶原蛋白肽也可作为调味品和功能性食品的添加剂[5]。鱼鳞胶原的降解产物也具有抗氧化、降血压、免疫调节等保健功能[6-8]。所以鱼鳞中胶原蛋白的提取和应用有很好的经济价值和应用前景。

目前国内外研究大都集中在优化热浸提，酸法，碱性蛋白酶法提取胶原蛋白的工艺研究[9]。酶法提取鱼鳞胶原蛋白能很好的增加提取率，而且木瓜蛋白酶相对对胶原作用较弱，只对胶原蛋白的非螺旋端肽，而不会对螺旋区进行水解，提取得到的酶溶性蛋白仍能保持结构的稳定性，对于胶原蛋白中特有的羟脯氨酸以肽的形式的保存率＞96%[10]。本实验利用响应面法优化木瓜蛋白酶提取鱼鳞胶原蛋白，旨在提高草鱼鱼鳞的胶原蛋白提取率，以期为充分利用草鱼鱼鳞资源，减少环境污染提供依据，并对提取的鱼鳞胶原蛋白性质进行初步研究，为其在食品加工中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验材料

草鱼鱼鳞：购于泰州农贸市场，清洗后沥干，置于-20℃保存备用。

1.1.2 试验试剂

木瓜蛋白酶（酶活力3 000 U/g）：上海聚源生物有限公司；乙酸、盐酸、氢氧化钠、羟脯氨酸、氯胺-T、对-二甲胺基苯甲醛、乙醇等均为分析纯：上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

HHS-11-2电热式恒温水浴锅：江苏金坛宏凯仪器厂；EL3002型精密电子天平：梅特勒-托多利仪器（上海）有限公司；DFT-100高速万能粉碎机：上海新诺仪器设备有限公司；BGZ-240电热鼓风干燥箱、722型分光光度计：上海精宏实验设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 鱼鳞前处理

将鱼鳞用流水清洗沥干后于1%盐酸中浸泡24 h，不时搅拌，中间换盐酸液一次。清水漂洗数次后置于2.5%氯化钠溶液中浸泡24 h，中间换氯化钠溶液一次。用自来水洗涤后再用蒸馏水洗涤，晾干备用。

1.3.2 鱼鳞胶原蛋白提取工艺[11-12]

1.3.3 单因素试验

准确称取经处理的5.0 g鱼鳞粉末，加蒸馏水制成混悬液，加入木瓜蛋白酶酶解。以胶原蛋白提取率为考察指标，对酶解温度、加酶量、底物质量分数进行单因素试验。

1.3.4 响应面试验设计

在单因素试验结果的基础上，以胶原蛋白提取率为优化目标，选择酶解温度、加酶量、底物质量分数三个因素，利用Design Expert 8.0软件，采用Box-Behnken试验设计方法，设计了3因素3水平共17个试验点的响应面试验[13-14]。响应面试验因素水平编码见表1。

表1 响应面试验因素与水平编码Table 1 Factors and levels of response surface method

1.3.5 鱼鳞胶原蛋白提取率的测定

羟脯氨酸为胶原蛋白特有的氨基酸，羟脯氨酸的含量与胶原蛋白的含量成正比关系[10]，胶原蛋白的提取率计算公式：

按照GB/T 9695.23—2008《肉与肉制品羟脯氨酸含量测定》的方法测定羟脯氨酸的含量。取羟脯氨酸0.001 g定容至100 mL，配制成质量浓度为10 μg/mL的母液，并以此稀释至5 μg/mL、4 μg/mL、3 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL，测定波长为558 nm，以测定的吸光度值（y）为纵坐标，羟脯氨酸质量浓度（x）为横坐标绘制标准曲线，得到标准曲线方程y=0.091 7x+0.012 9，R2=0.999 0。

1.3.6 鱼鳞胶原蛋白的部分特性研究

（1）吸水性和保水性的测定

吸水性测定：准确称取1.0 g鱼鳞胶原蛋白样品，置于已知质量的培养皿中，然后将其放入恒温恒湿生化培养箱中，调节温度25℃，相对湿度85%，每隔2 h测培养皿质量，直至质量不再增加，同时用甘油作对照。

式中：M2为培养皿和吸收水分的总质量，g；M1为培养皿质量，g；W为样品质量，g。

保水性测定：准确量取5 g/L的鱼鳞胶原蛋白溶液5 mL于一培养皿中，置于40℃，相对湿度15%的恒温恒湿培养箱中，每隔10 min测定一次样液的水分含量，同时用甘油作对照。

（2）乳化性和乳化稳定性测定

准确量取5 g/L的鱼鳞胶原蛋白溶液5 mL，加入10 mL色拉油，均质2 min，转移至刻度离心管中进行离心，记录乳化混合液的体积，通过下式计算鱼鳞胶原蛋白的乳化性：

制备的乳化液移入刻度试管内，置于50℃水浴锅中。每隔1 h记录乳化液体积的变化。通过下式计算鱼鳞胶原蛋白的乳化稳定性：

1.3.7 水分的测定

水分的测定参照GB 5009.3—2010《食品安全国家标准食品中水分的测定》中的方法进行测定[15]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 酶解温度对胶原蛋白提取率的影响

利用木瓜蛋白酶酶解提取鱼鳞中的胶原蛋白，在加酶量为3 g/L，底物质量分数为20%时，改变酶解温度分别为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，考察不同酶解温度对胶原蛋白提取率的影响，结果如图1所示。

图1 酶解温度对鱼鳞胶原蛋白提取率的影响Fig.1 Effect of hydrolysis temperature on extraction efficiency of collagen

由图1可知，在一定范围内随着温度的提高，胶原蛋白的提取率也逐渐增大。当温度到达50℃时，提取率达到最大值，之后提取率有所下降。究其原因是随着温度的升高，增加了木瓜蛋白酶水解底物的速度，使得胶原蛋白的提取率得到一定的提升，但是过高的温度也使得酶本身蛋白质结构改变，而导致酶的变性，使其催化活性降低。结果表明，50℃是木瓜蛋白酶提取胶原蛋白的最佳温度。

2.1.2 加酶量对鱼鳞胶原蛋白提取率的影响

用木瓜蛋白酶提取鱼鳞中的胶原蛋白，控制酶解温度50℃，底物质量分数为20%，考察不同的加酶量对鱼鳞胶原蛋白提取率的影响，结果如图2所示。

当底物量一定且其他环境也完全相同时，加酶量将影响酶解过程的酶解效果。由图2可知，加酶量为1～2 g/L时，木瓜蛋白酶水解程度增加，鱼鳞胶原蛋白的提取率有所增加，但当加酶量＞2 g/L时，随着加酶量的增加，胶原蛋白的提取率反而有一定程度下降，分析其原因，加酶量过大可能引起了胶原蛋白的过度水解。所以选取加酶量为2 g/L。

2.1.3 底物质量分数对胶原蛋白提取率的影响

用木瓜蛋白酶提取鱼鳞中的胶原蛋白，控制酶解温度在50℃，加酶量为2 g/L，考察不同底物质量分数对鱼鳞胶原蛋白提取率的影响，结果如图3所示。

图3 底物质量分数对胶原蛋白提取率的影响Fig.3 Effect of substrate concentration on extraction efficiency of collagen

由图3可知，当底物质量分数为10%～20%时，胶原蛋白的提取率逐渐升高，但当底物质量分数过大时，则不能最大程度的提取鱼鳞中胶原蛋白。因此选择底物质量分数为20%。

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 响应面试验结果

通过响应面法试验，能分析各因子之间的交互影响，又能建立准确合理的数学模型。在单因素试验的基础上，以胶原蛋白提取率（Y）为响应值，选取酶解温度、加酶量和底物质量分数的最佳作用范围，采用响应面法提取酶溶性鱼鳞胶原蛋白。结果见表2。

表2 胶原蛋白提取工艺Box-Behnken试验设计及结果Table 2 Box-Behnken design and corresponding experimental results for collagen extraction

采用Design-Expert8.0软件对表2进行回归拟合分析，得到回归方程模型方差分析结果见表3。

表3 胶原蛋白提取工艺回归模型方差分析结果Table 3 ANOVA for the regression equation describing the extraction process

由表3可以看出，模型P（0.000 3）＜0.001，达到极显著水平，失拟P值为0.137 1，不显著，因此二次模型成立。试验因子对响应值不是简单的线性关系，二次项对响应值也有很大的关系，对此进行多元回归分析，得到多元二次回归方程模型为：

由表3可以看出，影响木瓜蛋白酶水解提取鱼鳞胶原蛋白提取率的因素主次为C＞B＞A，即底物质量分数＞加酶量＞酶解温度。其中底物质量分数和加酶量对胶原蛋白提取率的影响均达到了显著水平。并且底物质量分数和酶解温度，加酶量和底物质量分数之间有交互作用，作用显著。模型的相关系数R达到了0.981 2，该模型与实际试验拟合良好。

2.2.2 鱼鳞胶原蛋白提取率最优工艺参数的确定

图4 各因素两两交互作用对鱼鳞胶原蛋白提取率影响的响应面和等高线Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factors on extraction efficiency of collagen

各因素交互作用对鱼鳞胶原蛋白提取率影响的等高线和响应面图（图4）可知，随着酶解温度和底物质量分数的增加，鱼鳞胶原蛋白提取得率先增大后减少，等高线呈椭圆形，说明酶解温度和底物质量分数的交互作用对鱼鳞胶原蛋白取得率有显著影响。随着加酶量和底物质量分数的增大，提取得率先增大后减小，等高线呈椭圆形，说明加酶量和底物质量分数对提取得率的影响也显著。从响应面的最高点和等高线可以看出，在所选范围内存在极值。

由模型可以得到提取的最优条件为酶解温度50.39℃，加酶量为3.63 g/L，底物质量分数为21.74%，胶原蛋白提取率的理论预测值可以达到15.604 8%。为了便于实际操作，控制最佳工艺参数，酶解温度为50℃，加酶量为3.5 g/L，底物质量分数为22%，经过验证胶原蛋白提取率为15.4%，说明试验拟合性能良好，该模型合理可行。

2.3 鱼鳞胶原蛋白的部分功能特性研究结果

2.3.1 吸水性与保水性

图5 鱼鳞胶原蛋白与甘油的吸水性(A)及保水性(B)比较Fig.5 Water absorption capacities(A)and water-holding capacities(B)of collagen and glycerol

由图5可以看出，鱼鳞胶原蛋白的吸水性略低于甘油的吸水性，但鱼鳞胶原蛋白的保水性优于甘油。原因在于鱼鳞胶原蛋白具有大量的亲水性基团，其独特的三螺旋结构也有效地保持其水分。

2.3.2 乳化性和乳化稳定性的研究

乳化性是指能将水和油结合在一起，形成乳状液的能力，而乳化稳定性是指油水乳状液保持稳定的能力。这两种性质决定了乳化剂在食品中的适用性。

图6 鱼鳞胶原蛋白乳化稳定性Fig.6 Emulsifying stability of collagen

经过测定酶法从鱼鳞中提取的胶原蛋白的乳化性为50%，从图6可知，鱼鳞胶原蛋白有一定的乳化稳定性。究其原因可能是木瓜蛋白酶的水解作用使处于内部的疏水性基团暴露与油相互作用，而亲水性基团则与水相互作用，降低了油水两相界面的张力，使互不相溶的两相形成了稳定的乳浊液。

3 结论

选用木瓜蛋白酶提取鱼鳞中的胶原蛋白，其酶解温度、加酶量、底物质量分数对鱼鳞胶原蛋白提取效果均有影响，影响的大小顺序为底物质量分数>加酶量>酶解温度。其中底物质量分数和加酶量对于胶原蛋白的提取影响达到显著水平，并且底物质量分数和酶解温度，加酶量和底物质量分数之间有交互作用。

应用Design Expert 8.0统计分析软件建立了鱼鳞胶原蛋白提取率回归模型：

通过单因素和响应面法分析确定提取的最优条件为酶解温度50℃，加酶量3.5 g/L，底物质量分数22%，经过验证，胶原蛋白提取率为15.4%。

对酶解提取到的鱼鳞胶原蛋白的性能研究表明，其吸水性接近于甘油，而保水性优于甘油，并且具有一定的乳化稳定性，可以很好的应用于食品工业中。

[1]石维焕，许永安.鱼鳞利用的研究进展[J].福建水产，2011，33（4）：67-71.

[2]段蕊，张俊杰，杜修桥.鱼鳞组成性质及其加工利用的研究进展[J].食品与机械，2006，22（5）：128-131.

[3]卢黄华，李雨哲，刘友明，等.草鱼鱼鳞胶原蛋白膜的制备工艺[J].华中农业大学学报，2011，30（2）：243-248.

[4]宋永，王海燕，李秀凉，等.鱼鳞水解胶原蛋白在蛋糕和灌肠中的应用[J].食品科学，2010，31（12）：293-296.

[5]顾杨娟，李杰，李富威，等.鱼鳞有效成分的研究进展[J].食品工业科技，2012，33（10）：415-448.

[6]蒋挺大.胶原与胶原蛋白[M].北京：化学工业出版社，2006.

[7]焦道龙，陆剑锋，张伟伟，等.水产动物胶原蛋白的研究现状及发展趋势[J].食品科学，2009，30（17）：334-338.

[8]NGO D H,QIAN Z J,RYU B,et al.In vitro antioxidant activity of a peptide isolated from Nile tilapia(Oreochromis niloticus)scale gelatin in free radical-mediated oxidative systems[J].J Funct Food,2010,2(2): 107-117.

[9]黄焕，王欣，刘宝林.鱼鳞胶原蛋白提取技术及其应用[J].食品科技，2009，34（1）：208-212.

[10]高建华，宁正祥.不同蛋白酶对鱼鳞胶原蛋白酶解产物的氨基酸分析[J].食品科技，2009，34（5）：117-119.

[11]严子军，纪洁清，刘永.响应面优化酶溶性罗非鱼鳞胶原蛋白的提取工艺[J].广东农业科学，2013，18（2）：86-88.

[12]刘艳，刘章武，唐婧苗，等.酶法提取4中淡水鱼鱼鳞胶原蛋白的研究[J].水产科学，2010，29（4）：221-224.

[13]费荣昌.试验设计与数据处理[M].无锡：江南大学出版社，2001.

[14]夏珊珊，曹少谦，刘亮，等.响应面法优化马面鱼皮胶原蛋白提取工艺及胶原组成分析[J].核农学报，2014，28（5）：869-875.

[15]中华人民共和国卫生部.GB 5009.3—2010食品安全国家标准食品中水分的测定[S].北京：中国标准出版社，2010.

Extraction of collagen from grass carp scale with papain by response surface methodology

ZHANG Jingjing,TANG Jinsong,WANG Haibo,LI Chaozhou,FENG Xiaorui
(Department of Food Science and Technology,Jiangsu Agri-Animal Husbandry Vocational College,Taizhou 225300,China)

The collagen from grass carp scale was extracted with papain,and the collagen properties were studied.On the basis of single factor experiment,Box-Behnken response surface methodology was used to optimize the technical parameters of temperature,enzyme addition and substrate concentration,to establish and analysis the mathematical model between various factors and collagen extraction yield.The optimal parameters were as follows:hydrolysis temperature 50℃,enzyme addition 3.5 g/L,substrate concentration 22%,and verification test showed that the collagen extraction ratio was 15.4%.The water absorption of collagen from grass carp scale was close to glycerin,and the holding water capacity was better than glycerin.The collagen from grass carp scale had good emulsion capacity and emulsion stability.

scales;collagen;response surface methodology;extraction;properties study

TS257.9

A

0254-5071（2014）10-0099-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.024

2014-08-10

2013年江苏省教育厅大学生实践创新训练项目（201312806010Y）

张璟晶（1981-），女，讲师，硕士，研究方向为食品质量与安全。