藤茶活性成分二氢杨梅素对明胶酶的影响

晏和娟，伍莉娟，郑小江，周防震

（湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北恩施445000）

藤茶活性成分二氢杨梅素对明胶酶的影响

晏和娟，伍莉娟，郑小江，周防震*

（湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北恩施445000）

该文探讨藤茶活性成分二氢杨梅素（DMY）对明胶酶酶活性和酶蛋白表达量的影响。通过收集不同质量浓度DMY处理的人乳腺癌细胞的条件化培养液上清液，取等蛋白质含量各处理组样本液，进行相同条件的明胶酶谱实验，以此检测DMY对明胶酶蛋白表达量的影响；收集未经过DMY处理的细胞培养液上清液，等量体积上样进行明胶酶谱实验的SDS-PAGE电泳部分，移除凝胶中SDS后置于含有不同质量浓度DMY的孵育液中进行孵育，以此检测DMY对明胶酶活性的影响。结果表明，20～80 μg/mL的DMY对明胶酶活性未见明显影响，但以剂量依赖方式抑制明胶酶蛋白的表达。这表明DMY抑制肿瘤转移的作用机制可能是通过抑制明胶酶酶蛋白的表达量，而不是通过抑制该酶活性来完成的。

二氢杨梅素；明胶酶；明胶酶谱

二氢杨梅素（dihydromyricetin，DMY）大量存在于藤茶（Ampelopsis grossedentata）幼嫩茎叶中。近来的报道表明，DMY具有抗氧化、抗炎、抗突变、止咳、化痰、抗菌和抗肿瘤[1-5]等多种生理活性。已有研究表明，DMY能抑制B16小鼠黑色素瘤细胞纤维连接蛋白、层粘连蛋白和基质胶的粘附，并且抑制细胞向重组基底膜的侵袭[6-7]。先期研究也显示DMY能抑制MDA-MB-231人乳腺癌细胞和小鼠乳腺癌细胞的侵袭和转移[8-9]。这些结果表明DMY是一个潜在的抗肿瘤转移制剂。

大量研究表明，肿瘤细胞分泌的明胶酶也叫IV型胶原酶，包括基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）和基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2），可降解IV型胶原、明胶和Ⅴ型胶原等基底膜成分，在癌细胞侵袭和转移过程中发挥重要作用。因为细胞从原发灶传播至远端必须穿透血管壁IV型胶原含量丰富的基底膜[10]。已有研究表明藤茶活性成分DMY对明胶酶有重要影响[11]，但是具体影响酶活性还是酶的表达量，抑或二者同时被抑制，尚未有定论。明胶酶谱法是明胶酶检测的重要方法之一。该方法是KLEINER等1994年建立的基于非还原十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）和反相凝胶染色的蛋白酶检测方法，是最早建立的明胶酶检测方法，也是目前最常用的明胶酶检测方法，能区分酶原和活化型酶两种形式，具有费用低、简便、敏感等特点[12]。因此，本实验以明胶酶谱法研究藤茶活性成分DMY对明胶酶蛋白表达量及水解活性的影响，以检测其可能的作用途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人乳腺癌细胞MDA-MB-231：暨南大学生物工程研究所。DMY：由华南理工大学工业技术研究总院提供（纯度99%）；二辛可宁酸（bicinchonininc acid，BCA）蛋白质定量试剂盒、青霉素-链霉素双抗溶液：碧云天生物技术公司；达尔伯克改良伊格尔培养基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）、胎牛血清：Gibco公司；细胞培养板：Corning公司；考马斯亮蓝、过硫酸铵、N,N,N',N'-四甲基乙二胺、丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺：北京鼎国生物技术有限公司；Triton X-100、L-甘氨酸、甘油、三羟甲基氨基甲烷（Tris）和十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）：广州国奥生物科技有限公司；明胶购于美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2F超净工作台：苏州净化设备公司；CO2细胞培养箱、台式低温高速离心机：美国Thermo公司；倒置生物显微镜：Olympus公司；微量移液器：德国Eppendorf公司；SDS-PAGE电泳套装：美国Bio-Rad公司；DYY-6C型电泳仪：北京六一仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 DMY对明胶酶蛋白表达量的影响

参考侯晓丽等[13]的方法，将处于对数生长期的MDAMB-231细胞接种于6孔培养板，调节细胞数量为2×105个/孔，每孔液体总体积2 mL。分别以质量浓度0、20μg/mL、40μg/mL和80 μg/mL的DMY处理48 h后收集各组细胞培养上清液（条件化培养液），按试剂盒说明进行BCA法蛋白定量。取等蛋白含量各组样本液（23 μg），加入上样缓冲液，按固定顺序加样于含0.1%明胶的10%SDS-PAGE凝胶孔中，80 V电压条件下进行电泳，待蛋白进入分离胶后，改为120 V继续电泳至溴酚蓝到达分离胶底部。取下凝胶，置于洗脱液（2.5%Triton X-100）中洗脱2次，每次30 min，然后用水漂洗3 min，换为孵育液（含0.05 mol/L Tris，0.05 mol/L氯化钙和0.2 mol/L氯化钠，pH 7.6），37℃温箱50 r/min振荡孵育40 h。0.1%考马斯亮蓝染色，脱色（体积分数30%甲醇，10%乙酸）至蓝色背景下白色条带清晰可见。实验重复3次。

1.3.2 DMY对明胶酶明胶水解活性的影响

以1.3.1中未经DMY处理的MDA-MB-231细胞培养上清液为样本，以等量体积上样进行明胶酶谱实验的聚丙烯酰胺凝胶电泳部分，孵育前不用DMY处理，孵育过程分别置于含有不同质量浓度DMY的孵育液中进行。其他条件和处理同1.3.1。

2 结果与分析

2.1 DMY对明胶酶蛋白表达量的影响

条件化培养液经BCA蛋白质定量后，进行等量蛋白上样，SDS-PAGE电泳后，胶块在不含DMY的孵育液中孵育40 h。明胶酶谱实验结果显示见图1，DMY以剂量依赖方式显著减少条件培养液中明胶酶的蛋白表达量，包括72 ku前体型、68 ku和62 ku活化型MMP-2蛋白以及92 ku MMP-9蛋白。

图1 二氢杨梅素对MDA-MB-231细胞明胶酶蛋白表达量的影响Fig.1 Effect of DMY on gelatinase protein expression of MDA-MB-231 cells

2.2 DMY对明胶酶明胶水解活性的影响

SDS-PAGE凝胶电泳后，胶块在含有不同质量浓度的DMY的孵育液中孵育40 h。明胶酶谱实验结果显示见图2，不同质量浓度的DMY（0、20 μg/mL、40 μg/mL和80 μg/mL）处理后，MMP-2（72 ku、68 ku和62 ku）和MMP-9（92 ku）明胶水解条带与对照组未见明显改变，表明DMY对明胶酶明胶水解活性没有显著影响。

图2 二氢杨梅素对MMP-2和MMP-9明胶水解活性的影响Fig.2 Effect of DMY on gelatinolytic activities of MMP-2 and MMP-9

早期的研究表明，人纤维肉瘤HT1080细胞条件化培养液明胶酶谱实验中发现有4条带，其中1条是92 ku的MMP-9和3条不同水解程度的MMP-2，分别是72 ku、68 ku和62 ku[14]。本研究发现，人乳腺癌MDA-MB-231细胞培养液明胶酶谱实验也呈现出4条带（图1和图2），不同的是其68 ku和62 ku条带不大规则，特别是68 ku MMP-2处的条带呈现发散状态，原因可能与其蛋白质的稳定性有关，在电泳过程中发生了蛋白质的降解，这与前人报道的明胶酶谱实验容易导致蛋白降解及部分酶活性丢失的结论是一致的[12]。

SDS-PAGE电泳后利用含阳离子去垢剂（Triton X-100）的洗脱液洗脱去除SDS，这一过程中引发了明胶酶酶原蛋白体外活化机制，酶原在凝胶内除掉一个约10 ku的小肽，转变为有活性的酶，降解凝胶中相应部位的明胶。已经被激活的明胶酶在去除SDS后也可以恢复酶活性[15]。这些是92 ku前体MMP-9和72 ku前体MMP-2能降解明胶的原因。该实验中未见MMP-9的活化形式条带出现，可能暗示人乳腺癌细胞条件化培养液中MMP-9蛋白的稳定性要远远强于MMP-2蛋白。

3 结论

通过明胶酶谱实验，检测藤茶活性成分二氢杨梅素对明胶酶酶蛋白表达量和水解活性的影响。结果表明，不同质量浓度（20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL）的藤茶活性成分DMY不影响明胶酶活性，却显著影响明胶酶蛋白表达量，说明其抑制肿瘤转移的作用机制可能是通过抑制明胶酶酶蛋白的表达量，而不是通过抑制该酶活性来完成的。

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Effect of active ingredient dihydromyricetin from Ampelopsis grossedentata on gelatinases

YAN Hejuan,WU Lijuan,ZHENG Xiaojiang,ZHOU Fangzhen*
(School of Biological Science and Technology,Hubei Minzu University,Enshi 445000,China)

The effect of dihydromyricetin(DMY)on gelatinase activities and gelatinase proteins expression was investigated.Human breast cancer cells were treated by different concentrations of DMY.The conditioned media were collected,and equal amount of proteins sample were analyzed by gelatin zymography,which helped to detect the effect of DMY on gelatinase proteins expression.Supernatant without DMY pretreatment were collected,and equal volume samples were loaded to conduct SDS-PAGE part of the gelatin enzyme spectrum experiment.After removal of SDS,the gels were incubated in incubation buffer containing different concentrations of DMY,by which to detect the effect of DMY on gelatinase activities. Result showed that 20-80 μg/ml DMY showed no obvious effect on gelatinases activities,but inhibited the gelatinases proteins expression in a dose-dependent manner.The DMY’s anti-tumor mechanism could be by restraining the gelatinases proteins expression,rather than by inhibiting the gelatinase activities.

dihydromyricetin;gelatinase;gelatin zymogram

R730.53

A

0254-5071（2014）10-0081-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.019

2014-07-26

湖北民族学院博士启动基金项目（MY2012B010）；湖北民族学院大学生创新训练项目（2013Z071）

晏和娟（1991-），女，本科生，研究方向为生物工程。

*通讯作者：周防震（1976-），男，副教授，博士，研究方向为酶工程与生物制药。