不同菌种发酵制备蚕豆酱的研究

刘莹，胡茂丰，刘素纯，3*，王巨涛，吴章华

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙410128；2.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙410128；3.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙410128；4.长沙市调料食品工程技术研究中心，湖南长沙410128）

不同菌种发酵制备蚕豆酱的研究

刘莹1，胡茂丰2，刘素纯1，3*，王巨涛4，吴章华4

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙410128；2.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙410128；3.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙410128；4.长沙市调料食品工程技术研究中心，湖南长沙410128）

本试验研究米曲霉、黑曲霉、黑根霉、高大毛霉4种不同单一菌种分别发酵制得的蚕豆酱中蛋白酶、淀粉酶活力及主要成分、酱色OD420nm值等指标在不同发酵时期的变化，并对发酵42 d的蚕豆酱进行感官评价。结果表明，米曲霉的中性及碱性蛋白酶活力较其他三种菌强，分别高达546.84 U和188.79 U。米曲霉发酵的蚕豆酱氨基酸态氮含量最高，可达1.381 g/100 g，根霉、黑曲霉次之，毛霉最少。米曲霉和黑曲霉制得酱的颜色深，酱色OD420nm值高，另两种霉制得酱的颜色较浅。米曲霉发酵制得蚕豆酱在色泽、气味和口感上都达到一级标准，是制作蚕豆酱的良好发酵菌种。

霉菌；蚕豆酱；发酵；品质

蚕豆酱是以去皮蚕豆为主要原料，经发酵制成的半流动状态的一类调味食品。我国生产蚕豆酱多采用自然发酵的方法，该方法的制曲过程是在开放式条件下进行，环境中的各种微生物混入后共同利用原料进行生长代谢，通过发酵、后熟等阶段后形成了蚕豆酱特有的色香味。研究表明，霉菌是在发酵过程中起主要作用的一类微生物，从酱曲中分离所得到的霉菌经鉴定主要有米曲霉、酱油曲霉、高大毛霉、黑曲霉等[1]。其中米曲霉菌种具有生长快、产孢量大，酶系丰富、不产毒素等特点[2]，因此目前生产蚕豆酱的制作工艺多使用该菌种作为发酵剂纯种发酵制作蚕豆酱，但制作出来的产品与自然发酵生产的相比，风味单一。近年来，针对此不足，很多研究学者都致力于利用米曲霉与其它菌种混合制曲发酵的工艺来提高蚕豆酱的质量，而不同微生物因其代谢途径的不同，会产生各类代谢物质，再加上微生物的自溶物等，这些物质相互作用，对于蚕豆酱的品质会产生不同的影响。因此，本试验拟以米曲霉、黑曲霉、高大毛霉、黑根霉四种不同单一菌种纯种发酵制作蚕豆酱，分析发酵过程中酱醅的蛋白酶活力、淀粉酶活力及主要营养成分、成品感官评价等指标的变化，旨在研究不同菌种对于蚕豆酱品质形成的差异，对丰富蚕豆酱的风味、提高蚕豆酱的质量具有积极的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验原料

麸皮：由湖南农业大学食品科技学院微生物教研室提供；去皮蚕豆及面粉：购于农贸市场。

1.1.2 菌种

黑根霉（Rhizopus nigricans）、高大毛霉（Mucor mucedo）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、黑曲霉（Aspergillus niger）由湖南农业大学食品科技学院微生物教研室提供。

1.1.3 培养基

菌种斜面活化培养基采用马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL。

菌种扩大培养基：在300 mL的三角瓶加入干麸皮10 g，按麸皮∶水=1∶1～1∶1.2（g∶mL）比例加水调配均匀，在121℃条件下灭菌30 min，冷却备用。

1.1.4 试剂

氢氧化钠、甲醛、3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、三氯乙酸、葡萄糖、10%盐水等均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

722s分光光度计：上海精密仪器仪表有限公司；TDL-40B型台式离心机：上海嘉鹏科技有限公司；MJ-II-B系列霉菌培养箱：上海精密仪器仪表有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵剂的制备

菌种活化：在无菌条件下，将米曲霉、黑曲霉、毛霉、根霉分别接种于PDA斜面培养基中，米曲霉、黑曲霉于30℃培养48 h，根霉于28℃培养60 h，毛霉于20℃培养60 h，备用。

麸曲制备：从试管斜面中取2～3环霉菌孢子接种到灭菌麸皮中，置于不同温度的恒温培养箱内培养，米曲霉、黑曲霉于30℃培养48 h，根霉于28℃培养60 h，毛霉于20℃培养60 h，期间扣瓶一次，待其长满孢子后，用牛皮纸包好整块麸皮置于45～50℃的烘箱中烘干24 h，即可制得发酵剂。

1.3.2 蚕豆酱工艺流程

1.3.3 工艺要点

预处理：将挑选好的去皮蚕豆淘洗干净，置于清水浸泡6 h左右，待其体积增加约一半后捞出。

灭菌：在121℃条件下灭菌5 min至蚕豆熟而不烂。

面粉处理：将面粉置于105℃干燥箱内烘烤1.5～2.0 h。按蚕豆质量的10%拌入面粉，搅拌均匀。

前期发酵：将蒸煮好的蚕豆，加入20%烘烤好的面粉拌合均匀，按照曲料（蚕豆+面粉）质量的0.3%分别接入米曲霉、黑曲霉、根霉、毛霉的麸曲菌种于不同温度培养，米曲霉、黑曲霉于30℃培养48 h，根霉于28℃培养60 h，毛霉于20℃培养60 h，制备曲坯。

加入食盐以及后期保温发酵：将由4种单一菌种分别制得的曲坯按坯∶盐水=1∶1（m∶m）的比例添加质量分数为10%的盐水，入坛后于40℃下保温发酵。

1.3.4 理化指标的测定

将发酵1 d、2 d、3 d、7 d、12 d、17 d、22 d、27 d、32 d、37 d、42 d的酱醅分别进行酶活力、氨基酸态氮、还原糖含量等主要指标的测定。

蛋白酶活力测定：福林试剂法[3]；淀粉酶活力测定：DNS试剂法[4]；氨基酸态氮含量测定：电位滴定法[5]；还原糖含量的测定：直接滴定法[6]。

1.3.5 酱色的差异分析

分别取发酵3 d、12 d、22 d、32 d、42 d的酱醅样品5 g，加入25 mL磷酸缓冲液匀浆，离心10 min，取上清液于波长420 nm处比色，以磷酸缓冲液为空白。

1.3.6 感官评价

感官评价参照刘素纯的方法[7]，以12人组成品评组，鉴于40 d左右理化指标等趋于稳定，对4种发酵42 d酱醅的四项感官指标进行分级检验，具体检验标准如表1所示。

表1 蚕豆酱感官评定标准Table 1 Sensory evaluation criteria of broad bean paste

2 结果与分析

2.1 不同单一菌种发酵蚕豆酱醅中蛋白酶活力的变化

分别对发酵1 d、2 d、3 d、7 d、12 d、17 d、22 d、27 d、32 d、37 d、42 d酱醅中的中性、酸性、碱性蛋白酶活力（以干基计）进行测定，试验结果见图1。

由图1可知，蚕豆酱中蛋白酶活力的变化的趋势基本为先增后减，由于各菌种在发酵前期的生长代谢旺盛，原料中蛋白质有诱导作用[8]，使得霉菌的产酶能力不断加强而酶活力增长较快。由图1（A）可知，米曲霉产中性蛋白酶的能力很强，根霉、毛霉次之，在发酵2 d时米曲霉的中性蛋白酶活力高达546.84 U，远远超过其他3种霉菌。由图1（B）可知，黑曲霉产酸性蛋白酶的能力较其他霉菌强，在发酵5 d后酸性蛋白酶活力仍有所增长。由图1（C）可知，米曲霉产碱性蛋白酶的能力较强，毛霉和根霉次之，黑曲霉最弱。在后期阶段，随着食盐水的加入和pH值的逐步减小，各蛋白酶活力都下降，原因之一是食盐的加入抑制了霉菌的生长，使得各菌种产蛋白酶能力减小，原因之二是随着发酵的进行，蛋白水解产物氨基酸、肽等抑制酶的形成，另外葡萄糖等易代谢的碳水化合物对蛋白酶的产生都有阻遏作用，因此会产生酶活力先增后减的趋势[9]。

图1 不同菌种发酵对蚕豆酱中性（A）、酸性（B）及碱性（C）蛋白酶活力的影响Fig.1 Effect of different moulds fermentation on neutral(A),acid(B) and alkaline(C)protease activity of broad bean paste

2.2 不同单一菌种发酵蚕豆酱醅中氨基酸态氮含量的变化

氨基酸态氮的含量是反映蚕豆酱质量的重要指标之一，其数值越高，表明菌种对蛋白质的分解能力越强，成品的滋味越鲜美。国家颁布的相关标准中也规定豆酱中氨基酸态氮的含量都不得＜0.6 g/100 g。本试验中分别对发酵1 d、2 d、3 d、7 d、12 d、17 d、22 d、27 d、32 d、37 d、42 d酱醅中的氨基酸态氮含量进行测定，试验结果见图2。

图2 不同菌种发酵对蚕豆酱中氨基酸态氮含量的影响Fig.2 Effect of different moulds fermentation on amino acid nitrogen content of broad bean paste

由图2可知，各菌种发酵的蚕豆酱中氨基酸态氮含量在主发酵过程中是上升的，成品中含量都达到国家标准。在发酵前期阶段，因为各菌种代谢旺盛，对氮源的需求量大，诱导菌种产蛋白酶能力不断增强，对原料中的蛋白质降解，游离氨基酸含量在发酵12～17 d中快速增加。由于米曲霉产中性和碱性蛋白酶能力较其它菌种强，由其发酵的蚕豆酱中氨基酸态氮含量是增长最快且含量较多，根霉和黑曲霉次之，毛霉最少，这是因为毛霉分解蛋白质的能力最弱，而黑曲霉产酸性蛋白酶能力较强，且酱曲发酵后总酸增加，pH值降至4～5左右时使得后期发酵过程中黑曲霉也占有一定优势，对蛋白质降解能力较毛霉强。在发酵后期，随着食盐水的加入和pH值的减小，菌种的生长代谢受到影响，酶活力被抑制，且食盐溶液也会使得原料中一部分的蛋白质溶出至发酵液中，从而使得蚕豆酱干基中的含氮物质减少，因此氨基酸态氮含量的增长速度减缓，基本保持平衡。

2.3 不同单一菌种发酵蚕豆酱醅中淀粉酶活力的变化

分别对发酵1 d、2 d、3 d、7 d、12 d、17 d、22 d、27 d、32 d、37 d、42 d酱醅中的淀粉酶活力进行测定，实验结果如图3。

图3 不同菌种发酵对蚕豆酱醅中淀粉酶活力的影响Fig.3 Effect of different moulds fermentation on amylase activity of broad bean paste

由图3可知，各菌种淀粉酶活力呈现先增后减的趋势，发酵前期增长速度较快，在发酵3～7 d左右基本达到最大值，不同菌种淀粉酶活力的变化表现为黑曲霉产淀粉酶能力最强，根霉和毛霉次之，米曲霉产淀粉酶能力较弱，最大值分别为78.47 U、62.33 U、49.34 U、42.13 U。这是因为发酵过程中酱醅的环境偏酸性，黑曲霉和根霉在酸性条件下产淀粉酶能力都较强[10-11]，因此黑曲霉和根霉能很好地进行生长代谢，有利于原料中碳水化合物的分解。后期淀粉酶活力的下降原因可能是因为食盐的抑制、菌体生长代谢减弱以及蛋白酶、脂肪酶等酶的影响而抑制了淀粉酶的活力。

2.4 不同单一菌种发酵蚕豆酱醅中还原糖的变化

蚕豆酱的原料是蚕豆和面粉，其主要成分是蛋白质、淀粉等，原料经过高温和高压处理后，淀粉糊化被霉菌所产的淀粉酶降解，经过一系列变化降解成还原糖等，这些糖类物质对于蚕豆酱的品质有着重要的影响。本实验分别对发酵1 d、2 d、3 d、7 d、12 d、17 d、22 d、27 d、32 d、37 d、42 d酱醅中的还原糖含量进行测定，试验结果如图4。

图4 不同菌种发酵对蚕豆酱中还原糖含量的影响Fig.4 Effect of different moulds fermentation on reducing sugar content of broad bean paste

由图4可知，酱醅中还原糖含量在发酵12 d左右达到最大值后开始减少。由于四种霉菌中黑曲霉的淀粉酶活力最强，由其发酵的蚕豆酱中还原糖含量增长最多，其次是根霉，而米曲霉和毛霉依次排后。随着发酵的进行，还原糖含量逐渐降低，分别由黑曲霉、根霉、毛霉、米曲霉发酵的蚕豆酱在发酵42 d后还原糖含量依次降至10.82 g/100 g、10.29 g/100 g、8.25 g/100 g、7.35 g/100 g。还原糖含量下降一方面是由于后期发酵中糖类物质被酵母菌和乳酸菌等其它微生物利用，另一方面是由于美拉德反应要消耗还原糖[12]，同时随着食盐加入及总酸增加等因素的影响，霉菌的生长代谢减弱，抑制了其淀粉酶活力，导致酱醅中还原糖含量减小。

2.5 不同单一菌种发酵后蚕豆酱酱色的变化

随着发酵的进行，酱醅中产生的黑色素会使酱的颜色逐渐变深，酱的颜色越深，则酱色OD420nm值越大。为比较不同菌种对蚕豆酱呈色的差异，本试验分别取各菌种发酵3 d、12 d、22 d、32 d、42 d的蚕豆酱进行酱色OD420nm值的测定，结果如表2。

表2 不同菌种发酵对蚕豆酱酱色的的影响(OD420nm值)Table 2 Effect of different moulds fermentation on OD420nmvalue of broad bean paste

由表2可知，各菌种酱色OD420nm值在发酵前12 d变化较明显，此时酱醅中黑色素的来源主要是酱曲中的酚类物质在多酚氧化酶的作用下氧化生成黑色素[13]，且发酵前期菌种多酚氧化酶活力较强。曲霉产酶能力较根霉和毛霉强，因此由黑曲霉和米曲霉发酵的蚕豆酱颜色较深。随着发酵时间延长，且保温发酵的温度达40℃，酱醅中多酚氧化酶活力减小，此时美拉德反应是黑色素的主要来源[14]，所以酱色OD420nm值变化幅度减小。

2.6 不同单一菌种发酵蚕豆酱的感官评价

感官评价是对产品品质最直观的反映，因此本实验对由这4种不同单一菌种分别发酵42 d的蚕豆酱醅进行感官评价，结果见表3。表3中数字表示认为产品是该级别的人数。

表3 不同菌种发酵后蚕豆酱各项感官要素评价的统计Table 3 Statistical analysis of sensory evaluation data

对表3评价结果进行X2检验处理[15]，得出米曲霉发酵制得的蚕豆酱在色泽、气味、口感方面都属于一级，通过对产品色、香、味方面的分析比较，确定由米曲霉发酵的蚕豆酱产品是较受欢迎的，米曲霉是制作蚕豆酱较理想的发酵菌种。

3 结论

通过比较四种不同单一菌种发酵的蚕豆酱在酶活力、成分及感官评价等指标上的变化，得出米曲霉的中性及碱性蛋白酶活力较其他3种菌强，可分别高达546.84 U和188.79 U。黑曲霉的酸性蛋白酶及淀粉酶活力较强。米曲霉发酵的蚕豆酱中氨基酸态氮含量最高，达到1.381 g/100 g，还原糖含量从高到低的顺序排列依次为黑曲霉、根霉、毛霉、米曲霉。对酱色OD420nm值的分析得出黑曲霉和米曲霉发酵的蚕豆酱颜色最深，根霉和毛霉发酵的蚕豆酱颜色较浅，感官评价的结果表明米曲霉在色泽、气味及口感上属于一级。

综合理化指标及感官指标考虑，米曲霉是制作蚕豆酱的良好发酵菌种，但是仍有一定的不足，在今后的实验中，可以通过混菌发酵工艺可以弥补其产酸性蛋白酶及淀粉酶能力的不足，使产品中氨基酸态氮及还原糖等营养物质的含量更高，达到丰富蚕豆酱风味的目的。

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Preparation of broad bean paste fermented by different moulds

LIU Ying1,HU Maofeng2,LIU Suchun1,3*,WANG Jutao4,WU Zhanghua4
(1.College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China; 2.College of Bioscience and Biotechnology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China; 3.Hunan Key Laboratories of Food Science and Biotechnology,Changsha 410128,China; 4.Research Center of Engineering and Technology for Seasoning Food,Changsha 410128,China)

The effect of Aspergillus oryzae,Aspergillus niger,Rhizopus nigricans and Mucor mucedo fermentation on protease activity,amylase activity,nutritional ingredients and OD420nmvalue of broad bean paste were determined,and sensory evaluation of the paste was conducted at the 42 d.The results showed that,neutral and alkaline protease activity of A.oryzae was stronger than the other three moulds,which were 546.84 U and 188.79 U, respectively.The amino acid nitrogen content fermented by each moulds in order was A.oryzae,R.nigricans,A.niger and M.mucedo,and the content in A.oryzae-fermented broad bean paste was 1.381 g/100 g.The pastes fermented by A.oryzae and A.niger were darker with higher OD420nmvalue,while the pastes fermented by the other two moulds were lighter with lower OD420nmvalue.The paste fermented by A.oryzae reached the first-level standard in color,flavor and taste,and it was the optimal mould in broad bean paste-making.

mould;broad bean paste;fermentation;quality

TS264.24

A

0254-5071（2014）10-0058-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.014

2014-08-11

湖南省科技计划项目（2012NK3072）

刘莹（1991-），女，硕士研究生，研究方向为营养与食品卫生学。

*通讯作者：刘素纯（1966-），女，博士，教授，研究方向为营养与食品卫生学。