川藏高原冰葡萄中五种酵母菌的鉴定及耐受性研究

蒋丽，邢亚阁，车振明*，孙丛珊，罗建峰

（1.西华大学生物工程学院食品生物技术重点实验室，四川成都610039；2.理县塔斯酒庄有限公司，四川阿坝藏族羌族自治州623100）

川藏高原冰葡萄中五种酵母菌的鉴定及耐受性研究

蒋丽1，邢亚阁1，车振明1*，孙丛珊1，罗建峰2

（1.西华大学生物工程学院食品生物技术重点实验室，四川成都610039；2.理县塔斯酒庄有限公司，四川阿坝藏族羌族自治州623100）

从川藏高原地区采摘的冰葡萄果实中分离纯化出了葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、解脂耶罗维亚酵母（Yarrowia lipolytica）和异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）5种菌株，采用18S rDNA D1/D2序列对菌株进行了鉴定，并对其耐受性进行了研究比较。结果表明：葡萄汁有孢汉逊酵母对蔗糖、乙醇和碱表现出较强的耐受性；酿酒酵母对酸表现出相对较好的耐受性；异常威克汉姆酵母对低温和二氧化硫表现出较强的耐受性。

冰葡萄；耐受性；分离鉴定

国际科学组织中对冰葡萄酒的定义是：将葡萄推迟采收，当气温低于-8℃使葡萄在树枝上保持一定时间，结冰，采收，在结冰状态下压榨、发酵，酿制而成的葡萄酒[1]。加拿大酒商质量联盟（vintners quality alliance，VQA）标准的定义是：气温-8℃以下，在葡萄树上自然冰冻的葡萄酿造的葡萄酒。冰葡萄酒有雷司令（Riesling）、威代尔（Vidal）、长相思（Sauvigon）、贵人香（Italian Riesling）等[2]。酵母菌是分属于子囊菌纲、担子菌纲、半知菌类的单细胞真菌微生物[3]。对于冰葡萄酒的酿造，酵母菌的作用必不可少。这些酵母菌主要来自葡萄浆果表面、土壤、酒厂设备以及人工接种[4-6]。冰葡萄酒相关酵母菌的生物多样性及种群构成是选育优良酿酒酵母菌中的基础与关键[7-8]，因此，研究不同酵母菌的种类及菌群动态变化，有利于在发酵过程中合理调控微生物，最大限度的发挥各类酵母菌的优点，促进优质冰葡萄酒品质的形成[9]。目前，对威代尔冰葡萄中毕赤酵母菌的耐受性进行初步的研究[10]以及对威代尔冰葡萄中酵母菌的分离、筛选及其耐受性作了初步研究[11]。真正优良的葡萄酒酵母，应具备起酵快，能耐乙醇、高浓度二氧化硫、低温等优点[12]。

利用基因测序方法，通过对威代尔冰葡萄汁发酵过程中的酵母菌葡萄汁有孢汉逊酵母、美极梅奇酵母、酿酒酵母、解脂耶罗维亚酵母和异常威克汉姆酵母五种菌株进行了分离鉴定，并进一步研究了该五种菌株的耐低温、耐酸碱、耐SO2和糖等性能，为川西藏区冰葡萄酒扩大生产提供了一定的技术支持，对川西高原冰葡萄酒行业的发展具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

冰葡萄：由四川阿坝州理县塔斯酒庄提供；体积分数为98%乙醇、94%亚硫酸、20%甘油、氯化镁等化学试剂：成都科龙化工厂；酵母菌18S rDNA序列分析和电泳检测所用试剂：成都东胜公司。

1.1.2 培养液与培养基[13]

酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基：酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，琼脂2%，pH自然，121℃灭菌20 min。

马铃薯葡萄糖（potato dextrose agar，PDA）培养液：马铃薯20%，葡萄糖2%。

WL营养琼脂培养基：酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖5%，琼脂2%。磷酸二氢钾0.055%，氯化钾0.042 5%，氯化钙0.012 5%，氯化铁0.000 25%，硫酸镁0.012 5%，硫酸锰0.000 25%，溴甲酚绿0.002 2%，将上述成分配好后加热溶解，pH 6.5，121℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

DHP-9052型电热恒温培养箱：上海益恒实验仪器公司；721分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；SHB-B型恒温振荡箱：金坛市富华仪器有限公司；pHS-25精密pH计：上海精科雷磁仪器厂；DYY-8型双定时电泳仪：郑州朋来仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分离

从酒庄运至实验室的威代尔冰葡萄进行榨汁处理，用WL培养基从葡萄汁中筛选出生长旺盛且特征明显的5株菌，通过平板划线分离出该五株菌的单菌落（分别对五株菌进行编号：JH、JH1、JH2、JH3、JH4）。挑取单菌落在液体PDA培养液中培养24 h后用甘油保存菌株，放置在-20℃备用。

1.3.2 菌株分子鉴定

采用18S rDNA序列分析法对分离出的菌株进行分子鉴定。采用玻璃珠法[14]提取基因组总DNA：聚合酶连反应（polymerase chain reaction，PCR）体系为30 μL重蒸水，5 μL 10×PCR扩增缓冲液，6 μL MgCl2（25 mmol/L），4 μL三磷酸脱氧核苷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（2.5 mmol/L），正向引物NS1（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′）和反向引物NS8（5′-TCCGCAGGTTC ACCTACGGA-3′）各1μL，1μL Tap聚合酶（2.5 U/μL），2μL总DNA模板。

PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，经30个循环后最终72℃保持10 min，然后等温度降到4℃停止运行。

1.3.3 耐受性实验

由于细菌悬液的浓度与混浊度成正比，因此，可利用分光光度计测定细菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，因此可以反应菌的生长状况。

（1）耐糖性分析：将实验菌株活化好接种不同的蔗糖含量（5%、25%、40%、55%、70%）的培养液中，接种量为1.0×108CFU/mL，25℃培养24 h，在波长600 nm处测其吸光度值。以不加菌液的YPD培养液为空白对照。

（2）耐酸碱性分析：根据葡萄汁的pH值，将实验菌株分别采用不同的pH值（1.5、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0）在25℃培养24 h，接种量为1.0×108CFU/mL，在波长600 nm处测其吸光度值，空白对照同上。

（3）耐温性分析：将实验菌株活化后接种于带有杜氏管的YPD培养液中，接种量为1.0×108CFU/mL，然后分别放于8℃、15℃、20℃、28℃、32℃条件下培养24 h，在波长600 nm条件下测其吸光度值，空白对照同上。

（4）耐二氧化硫分析：将实验菌株分别采用不同的二氧化硫质量浓度（100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、500 mg/L、600 mg/L、700 mg/L）在25℃培养24 h，在波长600 nm处测其吸光度值，空白对照同上。

（5）耐乙醇分析：将实验菌株分别采用不同的乙醇体积分数（4%、8%、12%、16%、20%）在25℃培养24 h，在波长600 nm处测其吸光度值，空白对照同上。

1.3.4 理化指标检测

pH的测定采用pH计法；二氧化硫含量采用碘吸收滴定法进行测定[16]（采用亚硫酸钠进行二氧化硫浓度调节）；蔗糖含量、乙醇含量采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定。

2 结果与分析

2.1 五株酵母菌的分离鉴定

图1 目的基因扩增电泳图(琼脂糖1%)Fig.1 PCR electrophoretogram of target gene(agarose 1%)

标准品基因和目的基因扩增电泳结果见图1。由图1电泳结果可知，对样本的18S rDNA基因进行PCR扩增，所扩增片段的大小约为1.8 kb，和真核生物的18S rRNA/DNA基因片段大小一致，因此达到了对酵母的18S rDNA基因的PCR扩增目的。通过基因测序，采用BLAST和ClustalX程序与GenBank中以收录的酵母18S rDNA D1/D2区序列比对，鉴定出JH、JH1、JH2、JH3、JH4五种菌株分别为葡萄汁有孢汉逊酵母、美极梅奇酵母、酿酒酵母、解脂耶罗维亚酵母、异常威克汉姆酵母。

2.2 酵母菌耐糖性分析

对于冰葡萄酒而言，在发酵初期，发酵液的糖度较高，达到38°Bx，但随着发酵的进行，残糖的下降速度也相对较快，因此酵母菌应该具有一定的耐糖性能，才能使冰葡萄酒的发酵顺利进行，不同蔗糖含量对酵母菌活性的影响结果见图2。由图2可知，5株菌的吸光度值都随着糖含量升高而降低，说明其生长都受到抑制。在蔗糖含量为70%时，该实验的五种菌株都有生长的迹象，但酵母菌的生长明显受到抑制，这五种菌的糖耐受性大小为JH＞JH2＞JH1＞JH4＞JH3。结果表明：这五种酵母菌对蔗糖都有一定的耐受性，JH的耐受性（其吸光度值为0.194）比其他四种酵母菌的耐受性强，JH3的耐受性最差（其吸光度值为0.058）。

图2 不同蔗糖含量对酵母菌活性的影响Fig.2 Effect of different sucrose concentration on activity of yeasts

2.3 酵母菌耐酸碱性分析

图3 不同的pH值对酵母菌活性的影响Fig.3 Effect of different pH value on yeasts activity

在葡萄酒酿造过程中，许多生化反应取决于pH值的大小而不是总酸。pH值的高低直接影响葡萄酒的感官质量和葡萄酒的生产工艺，对于研究酵母菌耐pH值的分析尤为重要。不同的pH值对酵母菌活性的影响见图3。由图3可知，JH3在各个pH值时，其生长状况比其他四种菌表现差，在pH值为1.5时，JH2（其吸光度值为0.112）生长状况最好，耐受性大小为JH2＞JH4＞JH1＞JH＞JH3；在pH为14时JH菌生长状况最好，其酸碱耐受性大小为JH＞JH4＞JH2＞JH1＞JH3。结果表明：这五种菌都有一定的耐酸碱性能，同一种酵母菌对酸和碱的耐受性不同，耐碱性比耐酸性强。

2.4 酵母菌耐低温性分析

在四川高原藏区，冰葡萄酒的发酵温度一般控制在10℃左右，而酵母菌发酵的最适温度高于此温度，这样使得冰葡萄酒原料能够在一定的低温条件进行长时间发酵，以此可以获得较好的冰葡萄酒品质。将分离纯化好的酵母菌接种于YPD培养液中，于不同的温度下培养，5株菌都随着温度的升高，其细胞数增加，结果见图4。由图4可知，该酵母菌在8℃下培养，其吸光度值分别为是0.605、0.735、0.635、0.365、0.786，表明该五种菌仍然有一定的生长能力，耐低温性大小为JH4＞JH1＞JH2＞JH＞JH3。结果表明，这五种酵母菌都具备低温发酵的能力，且最适发酵温度为28℃。

图4 不同的温度对酵母菌活性的影响Fig.4 Effect of different temperature on yeasts activity

2.5 酵母菌耐二氧化硫分析

图5 不同的二氧化硫质量浓度对酵母菌活性的影响Fig.5 Effect of different sulfur dioxide concentration on yeasts activity

在冰葡萄酒酿造过程中二氧化硫作为葡萄酒中十分重要的添加剂，它在葡萄酒的生产和贮藏中占有不可取代的地位。可以净化发酵基质、提高葡萄酒酒精度、提高有机酸含量、降低挥发酸含量，增加色度，改善葡萄酒的味感质量等。将分离纯化好的五株酵母菌分别接种于含不同二氧化硫质量浓度的YPD液体培养基中，结果见图5。由图5可知，在高二氧化硫质量浓度700 mg/L时，JH的生长受到抑制作用明显；JH4和JH2生长表现良好，其他菌也有生长的迹象。结果表明，该五种酵母菌都耐一定质量浓度的二氧化硫，且JH4菌耐受性能最高。

2.6 酵母菌耐乙醇分析

在冰葡萄酒酿造中，随着发酵的进行，葡萄醪中的酒精度会有一定的变化。不同的乙醇体积分数对酵母菌活性的影响见图6。由图6可知，五株菌的吸光度值都随着乙醇体积分数的增大而减少，当乙醇体积分数为20%时，JH生长良好，吸光度值为0.105；JH3明显受到抑制，吸光度值为0.051，其他菌在此体积分数下也有生长的迹象。结果表明，该五种菌对乙醇都具有一定的耐受性，JH耐乙醇性能最好。

图6 不同乙醇的体积分数对酵母菌活性的影响Fig.6 Effect of different ethanol concentration on yeasts activity

3 结论

该文研究了从四川藏区高原威代尔冰葡萄果实中分离纯化出的菌株葡萄汁有孢汉逊酵母、美极梅奇酵母、酿酒酵母、解脂耶罗维亚酵母、异常威克汉姆酵母，并采用18S rDNA D1/D2进行了基因鉴定。通过对这五种酵母菌耐受性实验分析，鉴定出的五种菌株分别在pH值为1.5和14.0的条件下均有一定的生长能力；在蔗糖含量70%条件下具有一定的生存能力；在8℃低温条件下时，虽然生长受到抑制，但是仍然表现有一定的生长率；在二氧化硫质量浓度为700 mg/L下和乙醇体积分数为20%的条件下，仍然有生长的迹象。结果表明，五株菌对乙醇、pH、蔗糖、低温、二氧化硫具有一定的耐受性，其中葡萄汁有孢汉逊酵母对蔗糖、乙醇和碱表现出较强的耐受性；酿酒酵母对酸表现出相对较好的耐受性；异常威克汉姆酵母对低温和二氧化硫表现出较强的耐受性。综合考虑，酿酒酵母对蔗糖、酸、二氧化硫、乙醇以及低温的耐受性最好。

此研究对筛选川西冰葡萄酒产区特色酵母菌，并构建出冰葡萄酒发酵微生物资源库具有重要意义。由于形成冰葡萄酒特有风味品质的发酵微生物菌群是相当复杂，研究仍然在继续，以期为川西藏区冰葡萄酒标准化生产提供技术支持。

[1]张平，元贤哲，李新榜.冰葡萄酒威代尔的酿造工艺[J].中外葡萄与葡萄酒，2009，6（1）：54-57.

[2]张炎.冰葡萄酒[J].酿酒，2007，34（5）：89-90.

[3]葛隐，唐圣云，赵东，等.五粮液窖池中耐酸性酿酒酵母菌的分离与筛选[J].中国酿造，2010，19（8）：130-132.

[4]杨雪峰，苏龙，刘树文.利用营养培养基鉴定葡萄酒中的相关酵母菌[J].中外葡萄与葡萄酒，2008，4（4）：4-7.

[5]王会会，刘天明，王可，等.烟台干红葡萄酒发酵过程中酵母种类鉴定[J].中国酿造，2011，20（1）：23-25.

[6]张红梅，郭俊艳，于莲波.葡萄酒的生产及对微生物的控制[J].食品工业，2003，5（4）：27-28.

[7]崔艳.菌种选育技术在葡萄酒酿造中的运用与发展[J].食品研究与开发，2011，32（9）：171-175.

[8]王慧.产地葡萄酒优良酵母菌株的筛选及鉴定[J].酿酒科技，2007，15（9）：29-34.

[9]郭志刚，刘天明，赵长增，等.甘肃天然优良酵母菌株的发酵特性评价[J].中国酿造，2008，27（11）：19-22.

[10]许青莲，邢亚阁，车振明，等.川西高原冰酒发酵中Pichia anomala的鉴定与耐受性研究[J].中国酿造，2013，32（8）：39-41.

[11]张丽珠，邢亚阁，许青莲，等.川藏高原威代尔冰葡萄中酵母菌的分离、筛选及其耐受性研究[J].中国酿造，2013，32（10）：94-97.

[12]程雷，李梓，王军.葡萄自然发酵过程中酵母菌的研究[J].中国食品学报，2010，10（2）：131-137.

[13]杨雪峰，苏龙，刘树文.利用营养培养基鉴定葡萄酒中的相关酵母菌[J].中外葡萄和葡萄酒，2008，4（4）：4-7.

[14]NAUMOVA E S,NAUMOV G I,MICHAILOVA Y V,et al.Genetic diversity study the yeast Saccharomyces bayanus var.uvarum reveals introgressed subtelomeric Saccharomyces cerevisiae genes[J].Res Microbiol,2011,162(2):204-213.

[15]赵祥杰，涂国全.一株桑葚果酒酵母的分离筛选及耐受性测定[J].酿酒科技，2007，4（1）：28-32.

[16]何红梅，薛则晓，曹晓炎.碘吸收滴定法测定食品中二氧化硫残留量[J].食品与机械，2006，22（3）：142-143.

Identification and tolerance properties of five kinds of yeasts in ice grapes in Sichuan Tibet Plateau

JIANG LI1,XING Yage1,CHE Zhenming1*,SUN Congshan1,LUO Jianfeng2
(1.Key Laboratory of Food Biotechnology,College of Bioengineering,Xihua University,Chengdu 610039,China; 2.Lixian Tasi Chateau Co.,Ltd.,Ngawa Prefecture 623100,China)

Hanseniaspora uvarum,Metschnikowia pulcherrima,Saccharomyces cerevisiae,Yarrowia lipolytica and Wickerhamomyces anomalus were isolated and purified from the fermentation process of the Sichuan Tibetan Plateau ice grape.Strains were identified by 18S rDNA D1/D2,and their tolerance were also studied and compared.Results showed the H.uvarum had strong tolerance capacity against sucrose,ethanol,and alkali,the Y.lipolytica had good tolerance capacity against acid,and W.anomalus had better tolerance capacity against low temperature and sulfur dioxide.

ice grape;tolerance;isolation and identification

TS261.1

A

0254-5071（2014）10-0036-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.009

2014-08-25

省科技支撑计划项目（2011SZ0284、2012SZ0117、13KCBZ0066）；2012年西华大学食品生物技术重点实验室开放研究基金资助项目（SZjj2012-005）；2013年西华大学研究生创新基金项目（ycjj201346）

蒋丽（1989-），女，硕士研究生，研究方向为食品科学。

*通讯作者：车振明（1960-），男，教授，本科，研究方向为食品发酵技术。