贝类派琴虫原位杂交检测方法的建立与应用

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（1.中国检验检疫科学研究院 动物检疫研究所，北京100029；2.内蒙古农业大学，呼和浩特 010018）

贝类派琴虫原位杂交检测方法的建立与应用

王彩霞1，冯春燕1，袁向芬1，邓俊花1，王宗祥2，吴绍强1

（1.中国检验检疫科学研究院 动物检疫研究所，北京100029；2.内蒙古农业大学，呼和浩特 010018）

本研究选择派琴虫特异性引物PerkITS85和PerkITS750的PCR扩增产物进行地高辛标记制备探针，探索建立了派琴虫的组织切片原位杂交检测方法，并应用该方法检测我国黄海海域采集的贝类样品。研究结果表明，PerkITS85和PerkITS750的PCR扩增产物大小为673bp，利用随机引物扩增法制备的派琴虫地高辛标记探针特异性好，与包纳米虫和尼氏单孢子虫均无交叉反应。以世界动物卫生组织（OIE）推荐的瑞氏液体羟基乙酸盐（RFTM）培养法为金标准对本研究建立的原位杂交检测方法进行评价，其诊断敏感性（Dse）为90.9%，诊断特异性（Dsp）为100%。实际检测应用表明本研究所建立的派琴虫原位杂交检测方法是一种有效的派琴虫检测方法，可以应用于派琴虫病的检测。

贝类；派琴虫；原位杂交；RFTM；检测

贝类派琴虫病（Perkinsosis）是由派琴虫引起的一种危害贝类养殖业的全球性疫病，病原包括奥尔森派琴虫（Perkinsus olseni）和海水派琴虫（P. marinus）等6个种[1]。目前瑞氏液体羟基乙酸盐（RFTM）培养法是世界动物卫生组织（OIE）推荐的派琴虫病金标检测方法[2]，敏感性高，但是特异性较差，与腰鞭毛虫有交叉反应，而且检测时间较长（需4～7天）[3-5]。

原位杂交技术（in-situ hybridization，ISH）是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一种检测技术[6]，始于20世纪60年代。1969年美国耶鲁大学的Gall等[7]首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，将该基因进行定位，从而创造了原位杂交技术。此后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是20世纪70年代末到80年代初，分子克隆、质粒和噬菌体DNA的构建成功，为原位杂交技术的发展奠定了深厚的技术基础。

本研究以OIE标准中的派琴虫PCR方法扩增获得目的基因，进行地高辛标记作为探针，在我国首次建立了派琴虫的石蜡切片原位杂交检测方法，并以OIE“金标准”RFTM培养法作为标准评价该方法的诊断特异性（Dse）和诊断敏感性（Dsp），同时应用该方法检测沿海随机采集的贝类样品。

1 材料与方法

1.1 样品

待检测样品：采自中国黄海海域的菲律宾蛤、青蛤、文蛤、牡蛎。

对照样品：本实验室保存的预先经鉴定感染包纳米虫的澳大利亚进口牡蛎[8]、采自我国广西及东部沿海海域并经鉴定感染尼氏单孢子虫的牡蛎[9]、采用PCR加测序方法鉴定感染奥尔森派琴虫[10]的菲律宾蛤仔和感染未定种派琴虫[11]（687bp）的菲律宾蛤仔。

阳性样品为RFTM检测感染了派琴虫的菲律宾蛤鳃和套膜组织；阴性样品为RFTM检测无派琴虫感染的健康蛤鳃和套膜组织。

1.2 主要试剂、标记试剂盒

Taq DNA聚合酶、dNTP购自宝生物工程（大连）有限公司；组织基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自QIAGEN（凯杰）公司；PCR DIG Probe Synthesis Kit购自德国Roche公司。

1.3 核酸探针的制备

1.3.1 引物设计合成

采用OIE推荐的根据派琴虫ITS序列设计的特异性引物PerkITS85和PerkITS750进行PCR扩增反应，预期扩增片段长度为673bp[2]，引物序列如下：

PerkITS-85：5’-CCGCTTTGTTTGGATCCC-3’

PerkITS-750：5’-ACATCAGGCCTTCTAATGATG-3’

上述引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成，用双蒸水稀释至10pmol/L，-20℃保存备用。

1.3.2 PCR扩增目的基因序列

取感染派琴虫的菲律宾蛤鳃组织25mg，采用Dneasy Blood&Tissue Kit（QIAGEN）按试剂盒说明提取基因组DNA，以引物PerkITS-85和PerkITS-750按照OIE推荐的反应程序进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳检测后，按照QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN）的试剂盒说明回收DNA片段。

1.3.3 地高辛标记派琴虫目的基因序列

取回收获得的DNA片段，采用Nanodrop-2000超微量核酸蛋白测定仪测定核酸含量，按PCR DIG Probe Synthesis Kit试剂盒说明进行标记。

1.3.4 探针标记效率与灵敏度测定

将对照DNA和标记好的探针分别按照PCR DIG Probe Synthesis Kit试剂盒说明进行稀释后，点样于尼龙膜上，然后按试剂盒说明进行显色。

1.3.5 探针特异性鉴定

采用Dneasy Blood&Tissue Kit（QIAGEN）按试剂盒说明提取对照样品感染了包纳米虫的澳大利亚进口牡蛎、感染了尼氏单孢子虫的我国广西及东部沿海牡蛎、感染了奥尔森派琴虫的菲律宾蛤仔和感染了未定种派琴虫的菲律宾蛤仔的基因组DNA变性后，分别取5μL点样于硝酸纤维膜上进行斑点杂交，检测探针的特异性。

1.4 派琴虫原位杂交检测方法的建立

1.4.1 石蜡切片制备

取感染派琴虫的菲律宾蛤仔鳃和套膜组织，用Davidson’s（或中性福尔马林）固定液固定24h后，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、最后浸蜡包埋成蜡块、切片（厚度为4µm），然后42℃展片到经聚赖氨酸处理过的载玻片上，56℃烤片过夜。

1.4.2 切片预处理

用预杂交液代替探针作为阴性对照，将做原位杂交的切片置60℃烘箱中烘30min，然后进行常规脱蜡、水化处理；将组织切片放到0.125mg/mL的链霉蛋白酶溶液中消化（37℃，30min），然后用0.2%的甘氨酸终止反应5min，用双蒸水洗5min，再在4℃的0.4%甲醛中后固定5min，再用PBS洗5min，最后自然风干。

1.4.3 原位杂交操作

将处理好的切片放入预热的预杂交液中，42℃预杂交1h。预杂交结束后，倒掉预杂交液，加入新的预杂交液，并在其中加入探针，使探针浓度为2ng/µL，42℃杂交过夜。杂交结束后，分别用含0.1%SDS的2×SSC和0.1×SSC在42℃各洗2次，每次15min；Washing Buffer中漂洗2次，每次10min；封闭液封闭30min；加抗体溶液室温孵育1h；Washing buffer冲去抗体溶液，并漂洗15min，2次；Detection Buffer中平衡切片2～5min；每片加200mL显色-酶作用底物溶液，置暗处显色；显微镜下观察，当出现阳性信号（组织细胞中有蓝紫色斑点），用TE-Buffer终止显色；切片经双蒸水及50%、70%、90%、95%、100%乙醇逐级快速脱水，晾干后，用中性树胶封片。

1.5 派琴虫原位杂交检测方法的评价

从待检样品中随机抽取20个菲律宾蛤仔，按照文献[2]介绍的RFTM培养方法进行派琴虫检测，同时留取蛤仔的鳃部和套膜按照1.4中的方法制备成石蜡切片，并进行预处理和原位杂交检测，比较RFTM方法与原位杂交方法的检测结果，并以RFTM方法为标准计算原位杂交检测方法的诊断敏感性（Dse）和诊断特异性（Dsp）[12]。

1.6 派琴虫原位杂交检测方法的应用

随机采集中国黄海海域的菲律宾蛤20个，青蛤、文蛤以及牡蛎样品各8个，打开贝壳，小心剪取样品的鳃组织，将修剪下的鳃组织用Davision’s固定液过夜固定后，制备成石蜡组织切片进行原位杂交检测，经过切片的预处理、杂交、洗涤、显色后，镜下观察不同种贝类产品的派琴虫感染程度。

2 结果

2.1 派琴虫ITS目的基因的PCR扩增

PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，并通过凝胶成像系统观察后发现在673bp处有目的条带（见图1），将目的基因片段切胶回收，纯化，并经超微量分光光度计（Nanodrop-2000）检测，派琴虫的胶回收产物浓度为：1号样品190 ng/ µL，2号样品201ng/µL，将其作为标记派琴虫核酸探针的模板。

图1派琴虫PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳

2.2 探针标记效率与灵敏度检测结果

探针标记效率检测结果如图2所示。2号标记的探针在0.1pg/µL稀释浓度时显色亮度和对照0.1pg/ µL稀释的亮度相当，推算出原标记液中探针的含量可达到理论值2000ng；而1号标记效率稍低，推算出探针含量为200ng。本研究采用2号探针进行进一步的研究，做Southern blot时，用杂交液将地高辛标记的探针稀释到25ng/mL使用，做切片原位杂交时，用杂交液将地高辛标记的探针稀释到2ng/µL使用。

图2探针标记效率检测结果

2.3 探针特异性检测结果

图3探针特异性检测结果

用制备的探针分别与包纳米虫、单孢子虫、未定种派琴虫以及奥尔森派琴虫的DNA在硝酸纤维素膜上进行斑点杂交，结果见图3。从图中可以看出，1号奥尔森派琴虫和2号未定种的派琴虫杂交结果呈阳性，奥尔森派琴虫的杂交信号较强，2号未定种的派琴虫相对弱，牡蛎包纳米虫和尼氏单孢子虫杂交结果呈阴性。说明该探针与单孢子虫、包纳米虫等其他牡蛎常寄生性原虫无交叉反应，且在派琴虫属内具有通用性。

2.4 派琴虫石蜡切片原位杂交检测结果

原位杂交结束后，显色封片，显微镜下观察整张片子，发现如图4所示，箭头所指处的蓝紫色斑点——派琴虫的特异性显色，可判定样品为派琴虫感染阳性。

图4 A 派琴虫感染蛤仔鳃组织石蜡切片原位杂交

图4 B 派琴虫感染蛤仔套膜组织石蜡切片原位杂交

2.5 派琴虫原位杂交检测方法的评价结果

分别以瑞氏液体羟基乙酸盐培养（RFTM）法和原位杂交法检测随机采集的20个样品。检测结果显示，RFTM组织培养方法检测出阳性11个，阴性样品9个；原位杂交检测方法检测出阳性样品10个（RFTM组织培养法阳性样品中的10/11），阴性样品10个（RFTM组织培养法阴性样品中的9/9）（表1）。以RFTM方法为标准，根据Dse和Dsp的计算公式得出本研究所建立的派琴虫原位杂交检测方法的DSe为90.9%，DSp为100%。

表1 RFTM培养法和原位杂交法的样品检测结果

2.6 派琴虫原位杂交检测方法的应用

应用本研究所建立的派琴虫原位杂交检测方法对采自中国黄海海域的菲律宾蛤、青蛤、文蛤以及牡蛎等样品进行检测，结果发现，20份菲律宾蛤中，10份为派琴虫感染阳性，10份为阴性；8份文蛤样品中，2份为派琴虫感染阳性，6份为阴性；8份青蛤和8份牡蛎样品均为阴性，这从另一个角度也反应了该原位杂交检测方法与蛤仔和牡蛎组织均无交叉反应，即没有非特异性检测结果出现。这表明本研究所建立的派琴虫原位杂交检测方法可以应用于贝类及其产品的派琴虫检测。

3 讨论

原位杂交技术的原理是依据核酸碱基互补配对原则，利用标记的特定序列探针与待测样本中的原位检测目的基因互补核酸序列杂交，经信号放大显色后镜下观察结果[13]。原位杂交和免疫组织化学相似，可以显示微生物病原在细胞内的定位和分布，并且较免疫组织化学更具有特异性和敏感性，目前在感染性疾病、细胞遗传性疾病和肿瘤三大类疾病[13]以及病毒[14]、寄生虫[15-16]等病原微生物检测方面，都有应用原位杂交技术的成功经验。

本研究根据原位杂交的原理，利用OIE推荐的引物PerkITS-85和PerkITS-750进行PCR扩增，回收PCR产物进行地高辛标记制备DNA探针，斑点杂交实验结果证明该探针与单孢子虫（Haplosporidium）、包纳米虫（Bonamia）等其他牡蛎常寄生性原虫无交叉反应，只对派琴虫属具有通用性。利用该探针在国内首次成功建立了派琴虫石蜡切片原位杂交检测方法。该方法与OIE标准中推荐的原位杂交检测方法有所不同，本研究中采用的是DNA探针，而OIE标准中采用的是根据派琴虫小亚基rRNA设计的寡核苷酸探针，虽然寡核苷酸探针具有可以人工用DNA合成仪合成，其长度及分子大小比较一致，可以控制的优点，但有些研究者认为寡核苷酸探针敏感度不如来自质粒扩增的cRNA探针或DNA探针[17]，因此本研究选用了敏感度较高的DNA探针。而且所使用的通用引物PerkITS85/PerkITS750在派琴虫属内有通用性，这在尚未明了感染派琴虫种类的情况下，有利于尽可能多地检获派琴虫病原。

本研究中将所建立的原位杂交检测方法与以OIE推荐的RFTM培养法作为金标准进行比较研究，得出原位杂交检测方法的诊断敏感性为90.9%，诊断特异性为100%，可能由于RFTM培养方法会对腰鞭毛虫产生交叉反应[18]，而该方法避免了与腰鞭毛虫产生交叉反应的问题，同时还可以消除PCR等分子生物学假阳性率过高的影响，从而导致诊断敏感性较低，但由此也证实该方法能够更加特异的检出派琴虫。此外，本研究还应用该方法对我国黄海海域采集的蛤仔和牡蛎样品的鳃及套膜组织的石蜡切片进行了派琴虫检测，结果表明本研究所建立的派琴虫原位杂交检测方法可以应用于口岸贝类派琴虫病的检测。

综上，本研究所建立的派琴虫石蜡切片原位杂交检测方法是一种有效的派琴虫检测方法，可以满足国内养殖场及进出口水生动物携带派琴虫的检测需求，有利于提高我国进出口贝类及其产品的质量安全，提升我国水产品的国际贸易声誉。

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Development and Application of an In-situ Hybridization Assay for Detection of Perkinsus spp. in Clams

Wang Caixia1，Feng Chunyan1，Yuan Xiangfen1，Deng Junhua1，Wang Zongxiang2，Wu Shaoqiang1
（1. Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100029；2. Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010018）

In this study，the conserved ITS fragment of Perkinsus was amplified by PCR using the genus-specific PerkITS85 and PerkITS750 as primers. The purifed amplicons were digoxigenin-labeled and used as probes in the in-situ hybridizatio（SH）assay. Clam samples from the Yellow Sea were collected and screened by the developed ISH assay to confrm the perkinsus infection status. Results showed that a 673bp fragment of perkinsus ITS gene was successfully amplifed by PCR. The digoxigenin-labeled probe showed high specifcity， without cross-reaction with Bonamia ostreae and Haplosporidium nelsoni and other aquatic parasites. The OIE recommended Ray’s fluid thioglycollate medium（RFTM）culture assay was used as gold standard to evaluate the developed ISH assay，and it was found that the DSe of the ISH assay was 90.9%，and the DSp was 100%. Field application indicated that the developed ISH assay was an effective detection method for perkinsus and could be applied to perkinsus detection.

clam； Perkinsus；in-situ hybridization； Ray’s fuid thioglycollate medium（RFTM） culture assay； detection

S944.344

：A

：1005-944X（2014）06-0079-05