传染性造血器官坏死病毒的新型环介导等温扩增（LAMP）荧光检测技术

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（深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，广东深圳 518045）

传染性造血器官坏死病毒的新型环介导等温扩增（LAMP）荧光检测技术

何俊强，史秀杰，卢体康，贾鹏，郑晓聪，于力，兰文升，王津津，刘荭

（深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，广东深圳 518045）

本研究建立了一种检测传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的新型荧光环介导等温扩增法，为实验室及现场检测IHNV提供特异性强、灵敏度高、快速、能实时观察扩增荧光信号的检测技术。针对IHNV全基因组序列设计了一组6条LAMP特异性引物，对4株不同来源的IHNV和8株不同的病毒进行特异性实验和灵敏度实验，结果表明该方法具有高度特异性，检测灵敏度可达3.64×10-7μg/μL，比常规RT-PCR高1000倍，与荧光RT-PCR方法相当。通过环介导等温扩增技术（LAMP）和荧光检测技术相结合，使其检测时间能缩短至15～20分钟内完成检测，并可杜绝由于开盖加染料而导致的假阳性率偏高问题，在鱼病快速检测上具有重要意义。

传染性造血器官坏死病毒（IHNV）；环介导等温扩增（LAMP）；荧光检测

传染性造血器官坏死病（infectious haematopoietic necrosis，IHN）是鲑鳟鱼类的一种严重的传染性疾病，常造成鱼苗或幼鱼70%～90%的死亡率，在某些病例中甚至接近100%，对世界鲑鳟鱼类养殖业造成了巨大的经济损失[1]。其病原为传染性造血器官坏死病毒（IHNV），病毒粒子形态为弹状，直径80nm～90nm，长度为160nm～180nm，有囊膜，属于鱼类弹状病毒（fsh rhabdovirus）[2]。由于该病对鲑鳟鱼类养殖造成的巨大危害，目前该病被世界动物卫生组织（OIR）列入水生动物疫病名录，我国将其列为二类动物疫病。

起初IHN只流行于北美洲和欧洲部分地区，1968年该病随红大麻哈鱼鱼卵从阿拉斯加传入日本北海道[3]，近来随着水生动物及其产品进出口贸易的急剧增加，又传入我国，并在我国局部地区流行[4]。目前常用于检测感染和非感染状态的IHNV的方法主要包括原位杂交、免疫组织化学、在体内进行检测的免疫金标记方法[5]、ELISA[6]以及RTPCR[7]、荧光RT-PCR[8]等分子生物学方法。而检测和诊断IHNV的经典方法是利用鱼类细胞系进行病毒分离，再通过抗体中和试验确认有无病毒。这种方法对于滴度较低的病毒感染很灵敏，但操作费时费力，通常在病毒感染很严重后才能出现明显阳性结果。本研究利用新型的荧光检测技术，成功建立了检测IHNV的环介导等温扩增（LAMP）荧光检测方法，能为实验室和现场检测提供一种更为快速和易于操作的检测方法，对本病快速检测具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 病毒悬液

4株不同来源的传染性造血器官坏死病毒（IHNV）分别为：IHNV-UK和IHNV-32-87（英国CEFAS赠送）、IHNV-S（中科院水生所赠送）、IHNV-20130238（本实验室分离保存）；4株同属弹状病毒科的粒弹状病毒属（novirhabdovirus）的水生动物病毒，分别为：鲤春病毒血症病毒（spring viraemia of carpvirus，SVCV）、牙鲆弹状病毒（hiramerhabdovirus，HRV）、病毒性出血性败血症病毒（viral haemorrhagic septicemia virus，VHSV）、 狗 鱼 幼 鱼 弹 状 病 毒（pike fryrhabdovirus，PFRV）[9]；4株常见的鱼类病毒分别为：鱼类病毒性神经坏死病病毒（viral nervous necrosis virus，VNNV）、鰤鱼腹水病毒（yellowtail ascites virus，YAV）、传染性胰腺坏死病毒（infectious pancreatic necrosis virus，IPNV）、传染性鲑鱼贫 血 病 病 毒（infectious salmon anaemia virus，ISAV）。其中SVCV、HRV、VHSV和VNNV病毒悬液均由本实验室分离保存；YAV和IPNV由中科院水生所赠送；PFRV由德国慕尼黑大学赠送；ISAV由ISA挪威OIE参考实验室赠送。

1.2 试剂

LAMP反应试剂Isothermal Master Mix为英国OptiGene公司产品；核酸抽提使用QIAamp Viral RNA Mini Kit为QIAGEN公司产品；AMV逆转录酶、One Step RNA PCR Kit（AMV）、One Step PrimeScript RT-PCR Kit均为Takara公司产品。

1.3 引物设计与合成

根据传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的全基因组序列（GenBankAccessionNo. X89213.1），使用LAMP Designer软件（http：//www.optigene. co.uk/lamp-designer/）设计一组6条LAMP的特异性引物（表1）：正向外引物（F3）、反向外引物（B3）、正向内引物（FIP）、反向内引物（BIP）、环状正向引物（LF）、环状反向引物（LB）。

表1 IHNV环介导等温扩增设计引物序列

1.4 病毒RNA提取

病毒RNA提取按照QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini Kit（50）试剂盒使用说明书进行，RNA浓度使用Eppendorf BioPhotometer测定。荧光PCR和常规PCR灵敏度对比试验使用同批次提取的核酸。

1.5 LAMP反应

LAMP反应使用OptiGene Isothermal Master Mix反应试剂，25 μL反应体系中包含：F3和B3引物各0.2 μmol/L，FIP和BIP引物各1.6 μmol/ L，LoopF和LoopB引 物 各0.8 μmol/L，1X的Isothermal Master Mix（包含BstTaq酶、dNTP、Mg2+及优化LAMP反应成分），AMV逆转录酶2.5 U，2.5μL待测RNA模板。设置反应梯度温度61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃等8组温度，放置预定时间（60min）。最后升高至98℃，以0.05℃/S的速度降温至80℃做溶解曲线，反应约6min终止反应。实时观察荧光信号的收集情况，通过荧光扩增曲线分析以确定最佳反应条件，同时观察溶解曲线峰值图，确认其特异性。最后将LAMP产物（5μL）用1.5%琼脂糖凝胶电泳或加入核酸染料进一步确认。

1.6 RT-PCR反应

使用1对IHNV特异性引物（正向引物5’-AGA-GAT-CCC-TAC-ACC-AGA-GAC-3’；反 向 引 物5’-GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTGCAA-3’）[10]进行RT-PCR反应。RT-PCR使用Takara One Step RNA PCR Kit（AMV）反应试剂盒，50μL反应体系中包含：1×buffer，0.5mmol/ L MgCl2，0.2 mmol/L dNTP，40 μmol/L正向引物，40 μmol/L反向引物，Taq酶5 U，AMV逆转录酶5 U，RNA酶抑制剂40 U，2.5 μL待测RNA模板，DEPC水补足25μL。设置反应程序：50℃30min； 95℃ 2min；之后95℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 1min进行30个循环；再72℃ 7min ；4℃保存。最后将RT-PCR产物（5 μL）用1.5 %琼脂糖凝胶电泳进行判断，扩展693 bp大小为阳性。

1.7 实时荧光RT-PCR反应

使用1对IHNV特异性引物（正向引物5’-GGT-CGC-CGA-ACT-TCT-GGA-A-3’；反向引物5’-GTG-CCC-CAG-TGT-CCA-AAG-A-3’），及1条IHNV特异性探针（探针5’-FAM-CCCTGG-GCT- TCT-TGC-TGG-A-TAMRA-3’）[11]进行荧光RT-PCR反应。荧光RT-PCR使用Takara One Step PrimeScript RT-PCR Kit反应试剂盒，25 μL反应体系中包含：1X One Step RT-PCR BufferⅢ（包含dNTP Mixture，Mg2+以及优化的PCR反应成分），1X Rox Reference DyeⅡ，1X PrimeScript RT Enzyme MixⅡ，EX Taq HS（2.5 U），0.2 μmol/L正向引物，0.2 μmol/L反向引物，0.1 μmol/L探针， 2.5μL待测RNA模板，DEPC水补足25μL。设置反应程序：50℃ 2min；95℃10min；之后95℃ 15s，60℃ 1min，进行40个循环；通过荧光PCR仪收集荧光信号后判断。

1.8 IHNV LAMP灵敏度测定实验

将IHNV-20130238核酸（36.4 μg/μL）10倍系列稀释的每个稀释度作为反应模板。使用优化后的LAMP方法来测定其检测下限。同时使用相同稀释度的模板（2.5 μL）进行RT-PCR和荧光RTPCR检测，对比三种方法的检测灵敏度。

1.9 IHNV LAMP特异性检测实验

使用优化后的LAMP方法，对4株不同来源的IHNV和8种其他水生动物病毒（SVCV、HRV、VHSV、PFRV、VNNV、YAV、IPNV、ISAV）模板进行特异性实验。

2 结果

2.1 LAMP反应优化

使用IHNV-32-87（0.5 μg/μL）作为模板进行LAMP反应，以确定最佳的反应温度和反应时间。于61℃- 68℃进行梯度扩增，其中62℃～67℃LAMP扩增的峰值强度和峰值时间均比较稳定，以最早的峰值时间（PeaksPositor）作为判断依据，66℃时峰值时间最早为15：36（图1a-b）。因此，选择66℃作为最佳温度。为保证反应体系中低浓度模板也能检出阳性，故选择60min作为优化后的反应时间。

2.2 IHNV-LAMP灵敏度对比实验

图1 IHNV反应温度梯度实验

IHNV-LAMP检测方法使用6条引物，在66℃下反应60min，测定其检测下限。LAMP反应、RT-PCR和荧光RT-PCR使用2.5μL相同稀释倍数的IHNV-20130238核酸（36.4μg/μL）作为模板。LAMP检查IHNV-20130238的极限为10-6（约3.64×10-7μg/μL）（图2a-b），荧光RT-PCR检测极限为10-6（约3.64×10-7μg/μL）（图2c），RT-PCR检测极限为10-3（约3.64×10-4μg/μL）（图2d）。结果表明，LAMP检测灵敏度是与荧光RT-PCR的灵敏度相当，是普通RT-PCR灵敏度的1000倍。

2.3 IHNV-LAMP的特异性检测实验

使用LAMP方法对4株不同来源的IHNV，4种同属水生动物弹状病毒SVCV、HRV、VHSV、PFRV，和4种无关鱼病VNNV、YAV、IPNV、ISAV提取的核酸进行特异性反应。其中4株不同来源的IHNV均能扩增。4株IHNV的峰值时间（PeaksPositor） 分别为13∶33、10∶33、9∶18、14∶48。其他8种病毒均无扩增（图3a-b）。结果表明，LAMP检测IHNV的方法具有很好的特异性。

3 讨论

IHNV是海洋水产养殖业中最严重的病毒性病原之一。20世纪四、五十年代， IHN在美国首次暴发。最初主要对北美太平洋沿岸养殖的鲑科鱼类造成严重的经济损失[12]。但随着各国养殖业的发展和水产品贸易的开展，IHNV不断蔓延，给各国淡海水养殖业造成巨大危害。目前，IHNV已经蔓延至台湾、日本、意大利、英国、法国、中国和韩国等国家和地区，感染鱼类包括虹鳟（Oncorhynchusmykiss）、红大麻哈鱼（O.nerka）、大麻哈鱼（O. keta）、大鳞大麻哈鱼（O. tshawytscha）、细鳞大麻哈鱼（O.gorbuscha）、银大麻哈鱼（O.kisutch）、马苏大麻哈鱼（O.masou）、玫 瑰 大 麻哈 鱼（O. rhodurus）、 大西 洋 鲑（Salmosalar）、 河 鳟（S.trutta）、 太 平 洋 鲱（Clupeapallasi）和管吻刺鱼（AuLorhynchusfavidus）等[13-16]。目前一些用于检测感染和非感染状态的方法主要包括原位杂交、免疫组织化学、在体内进行检测的免疫金标记方法、ELISA以及RT-PCR、荧光RT-PCR等分子生物学方法。

图2 IHNV灵敏度测定对比实验

图3 IHNV特异性检测实验

近年来环介导等温扩增技术（LAMP）已被开发应用[17]，国内外已建立多种重要经济水生动物病毒感染的LAMP检测方法[18-21]。其采用特异性识别靶序列上的6个位点的4条引物，及一种具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件进行核酸指数级扩增，在扩增反应中产生茎环结构，引物与其杂交启动新的一轮核酸合成[22]。最后利用荧光染料直接染色，并通过核酸染料颜色的变化来判定[23]，或使用溴化乙锭凝胶电泳方法观察。还有一种方法是通过浊度分析仪来检测LAMP的焦磷酸盐沉淀来判定LAMP检测结果[24]。但在实际中使用该方法的检测灵敏度不如荧光染料法和电泳法，灵敏度相差达100倍以上[25]。

LAMP具有等温扩增、高效灵敏、特异性高、检测快速、对仪器要求低、操作简便等特点，十分适合在野外渔场开展检测。但对于相对封闭的环境中如检测实验室等检测时，其需要在LAMP反应后开盖加入核酸染料来进行判定，由于LAMP方法的高效扩增性，使得在封闭环境中很容易形成带有相关核酸片段的气溶胶，造成长期检测相同项目时容易出现假阳性率偏高的情况。这也是目前阻碍LAMP检测技术全面推行的主要瓶颈。

本研究采用荧光检测技术对LAMP的扩增产物进行荧光收集，使用488nM激发光源，520nM发射热循环荧光监测，实时收集记录LAMP反应扩增的荧光信号，得到类似于荧光PCR的“S”型扩增曲线，能直观的观察到待测样品的检测结果。通过溶解曲线分析，还可进一步确认其扩增的特异性。在特异性实验检测中，我们利用了4株不同来源的IHNV与4种同属水生动物弹状病毒（SVCV、HRV、VHSV、PFRV）提取的核酸，以及4种无关鱼病（VNNV、YAV、IPNV、ISAV）提取的核酸进行特异性实验。同属水生动物弹状病毒以及其他无关的鱼类病毒均无扩增，4株IHNV均能在短时间内检测出来，峰值时间（PeaksPositor）分别为13∶33、10∶33、9∶18、14∶48。可见一般在10～20分钟内可完成检测，相对普通RT-PCR和荧光RTPCR方法至少需要2～3小时，和传统LAMP检测需要45～60分钟来说，本研究能在更短的时间完成IHNV的LAMP检测。这主要得益于我们采用了更为灵敏的荧光检测技术作为数据读取的手段，通过荧光的叠加收集，能更快、更及时的反映样品检测情况，故能更早的发现其扩增产物。

在做灵敏度测试实验时，我们使用相同稀释倍数的IHNV-20130238核酸（36.4μg/μL）作为模板，分别与普通RT-PCR和荧光RT-PCR作对比实验，通过软件分析我们得出等同于荧光PCR“CT值”的出峰值时间（PeaksPositor），结果表明本研究LAMP检测下限可达3.64×10-7μg/μL。检测灵敏度与荧光RT-PCR灵敏度相当，是普通RT-PCR灵敏度的1000倍。

最后，针对IHNV本研究建立的LAMP荧光检测技术，是一种全新改进的恒温核酸扩增方法，与其他分子生物学检测及时相比，其操作更为简便和更为快速。同时改进了传统LAMP染料法观察需要开盖加核酸染料的弊端，能杜绝假阳性的出现，并能做到实时分析。是一种灵敏、特异、快速，十分有效的新型检测方法。

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A novel loop-mediated isothermal amplifcation assay for the detection of infectious haematopoietic necrosis virus

He Junqiang，Shi Xiujie，Lu Tikang，Jia Peng，Zheng Xiaocong，Yu Li，Lan Wensheng，Wang Jinjin，Liu Hong
（Animal & Plant Inspection and QuarantineTechnology Center，Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shenzhen，Guangdong 518045）

A loop-mediated isothermal amplifcation assay（LAMP）for the detection of infectious haematopoietic necrosis viru（IHNV was established in this study. This novel method could be used in IHNV detection with high specifcity，sensitivity and rapidity both in the laboratory and feld conditions. A set of 6 LAMP primers were designed based on IHNV genome sequence. 4 IHNVstrains from different sources and 8 other viruses were involved in specifcity and sensitivity tests. The results indicated that the specifcity was high，and the detection limit was 3.64×10-7μg/μL，1000 fold higher than the conventional RT-PCR and same as real-time RT-PCR. The combination of LAMP and real-time RT-PCR could decrease the required detection time to 15-20 min and reduce the false positive rate caused by lid opening.

infectious haematopoietic necrosis virus（IHNV）；loop-mediated isothermal amplification assay（LAMP）；fuorescence detection

S851.347.34；S941.414

：A

：1005-944X（2014）06-0068-06

质检公益性行业专项（201210055和201210214）；质检总局科研项目（2012IK032）

刘荭liuhong@szciq.gov.cn