均相光激化学发光免疫分析技术的研究进展

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（1.重庆理工大学，重庆南岸 400000；2.重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心，重庆江北400020；3.重庆大学，重庆沙坪坝 400030）

均相光激化学发光免疫分析技术的研究进展

张存亮1，2，聂福平2，3，王昱2，3，杨俊2，李应国2，蔡家利1

（1.重庆理工大学，重庆南岸 400000；2.重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心，重庆江北400020；3.重庆大学，重庆沙坪坝 400030）

均相光激化学发光免疫分析技术是一种基于纳米微珠的化学发光的新型技术，其具有更高的敏感度、均一性、背景低，且不用洗涤及样本需求量少等特点。该技术可用于生物标志物、激酶及抗原抗体的检测，蛋白：蛋白相互作用的检测，高通量分析的研究及疾病诊断等方面。优化和发展均相光激化学发光免疫分析技术将会在更多研究领域中得到应用。

均相光激化学发光免疫分析技术；检测；发展

均相光激化学发光免疫分析（AlphaLISA）技术起源于20世纪90年代问世的光激化学发光（LOCI）技术[1]。均相光激化学发光免疫分析技术与传统的酶联免疫吸附实验相比，实现了免清洗和高通量检测，并具有高敏感性、高特异性、样本需要量少等特点，使其成为一种新型的快速检测技术。在此，对该技术的原理、特点及国内外的研究现状综述如下。

1 均相光激化学发光免疫分析技术原理[2]

AlphaLISA技术中蓝色珠子是供体微珠，其表面包被有链霉亲和素及光敏剂；红色珠子是受体微珠，其表面包被有化学发光剂和镧系元素铕（见图1）。技术原理：将抗待分析物的一种抗体生物素化，由于链霉亲和素和生物素发生反应而结合，同时将抗待分析物另一种抗体包被在受体微珠上，当反应体系中存在待分析物，供体微珠和受体微珠会由于抗原-抗体的特异性反应而相互接近。在680nm的激光照射下，供体微珠上的光敏剂将周围环境中的氧气激发为单线态氧分子。当单线态氧分子扩散到受体微珠时，与其上的化学发光剂产生一系列化学发光反应，最后将能量传递到铕上，在615nm发射波长产生信号。

图1 AlphaLISA技术原理示意图

2 均相光激化学发光免疫分析技术特点

AlphaLISA技术中微珠均为纳米微粒，增加了反应表面积，极大地提高了检测灵敏度；恰当的荧光波长及时间分辨计数模式，增加了其特异性；检测过程不易受到样本常见干扰物质、pH值、温度等因素的影响，保证了检测稳定性[3]。该技术操作非常简便，整个实验流程只需要2 h，检测的总体积为25 µL。

3 国内外的研究现状及应用

随着均相光激化学发光免疫分析技术不断优化，该技术在生物标志物、激酶及蛋白：蛋白相互作用、疾病检测和高通量筛选中发挥重要作用。

3.1 血清和血浆中蛋白质、激素、活性酶含量的检测

前列腺特异性抗原是由前列腺上皮细胞产生的单链糖蛋白，检测血清中该单链糖蛋白的含量在前列腺癌的早期诊断中具有重要作用[4]。邹丽萍等研究表明，AliphaLISA技术检测其含量，具有高的敏感性和精确度，可用于临床检测和基础医学研究[5]。

高血压是目前威胁人类健康的严重疾病之一，血管紧张素Ⅰ在高血压中发挥着重要的作用。Elizabeth Cauchon 等学者研究表明[6]，AliphaLISA技术在血浆中能够检测血管紧张素Ⅰ的含量，用来评价临床中或临床前的高血压治疗药的效果。

泛素－蛋白酶体途径是真核细胞内一种高效的蛋白降解路径，尤其是E3连接酶已被阐述清楚在癌症、炎症和代谢疾病中参与这个路径。研究发现，E3连接酶活性的失调与多种疾病发生机理有关。因此，使用AlphaLISA技术检测该连接酶的含量，进而检测泛素化蛋白[7]。

3.2 蛋白质：蛋白质的相互作用

蛋白质与蛋白质之间相互作用是细胞生化反应的一个主要组成部分，蛋白质间相互作用网络对调控细胞及其信号有着重要意义。研究蛋白相互作用的方法很多，而AlphaLISA技术成为研究蛋白质间相互作用的一种新方法。在丙型肝炎病毒（HCV）编码的非结构蛋白NS5A与亲环蛋白A之间的相互作用的研究中得到了证明[8]。

3.3 AlphaLISA在高通量筛选中作用

高通量筛选（HTS）是指运用自动化的筛选系统在短时间内、在特定的筛选模型上完成数以千计、甚至数以万计样品的活性测试。AlphaLISA技术在小分子高通量筛选中应用很广泛；同时，AlphaLISA技术用于受体的激活剂和抑制剂的高通量筛选及对若干个先导化合物的高通量筛选，成功并得到后续实验证实[9]。

3.4 在疾病及病原体诊断中的应用

目前，肺癌是世界范围内死亡率较高的癌症之一，患者血清中的糖蛋白作为检测肺癌的生物标志物日益受到关注，特别是上皮细胞钙粘蛋白。Chuling Wen 等人研究表明，使用AlphaLISA技术检测上皮细胞钙粘蛋白的岩藻糖基化标志物，可诊断出是否患有转移性肺腺癌[10]。

甲型肝炎是一种由甲型肝炎病毒引起的急性传染性疾病。现阶段，甲型肝炎在我国的发病率有所下降，但是却常有暴发流行，建立一种快速有效的检测方法非常重要。韩俊等研究表明[11]：使用AlphaLISA技术检测甲型肝炎病毒，可以快速准确的诊断出甲型肝炎。

手足口病是肠道病毒引起的传染病，肠道病毒71型是引起感染的主要病原。董小平等人研究，建立了基于抗肠道病毒71型衣壳蛋白1 IgM AlphaLISA检测方法，该方法具有特异性好、灵敏度高、用量少等优点。

老年痴呆症是一种不可逆的神经组织退化性疾病。淀粉样蛋白是老年痴呆病理中的一个重要致病分子，其经蛋白酶裂解后形成具有神经毒性的淀粉样肽。Christiane Rose等研究表明[12]，传统检测技术（Western-Blot和ELISA等）的检测结果不一致，就需更加灵敏和特异的检测技术-AlphaLISA技术。

4 展望

AlphaLISA技术和ELISA方法相比较的优势是均相、免清洗和在效率、精确度和质量上固有的特性。AlphaLISA是一种基于微量检测和微量样品就可以实现操作的技术，并且有较好的重复性、灵敏度、特异性和时效性，更适用于高通量检测。这些优势使得AlphaLISA技术成为未来高通量血清学诊断需求平台中引人注目的选项，同时在疾病潜伏期和临床研究中具有非常广阔的应用领域。

[1] Ullman E F， Kirakossian H， Switchenko A C， et al.Luminescent oxygen channeling assay （LOCI）： sensitive，broadly applicable homogeneous immunoassay method[J]. Clin Chem ，1996， 42（9）：1518-1526.

[2] Beaudet L， Rodriguez-Suarez R， Venne M H， et al.AlphaLISA immunoassays： the no-wash alternative to ELISAs for research and drug discovery[J]. Nature Methods，2008， 5：8-9.

[3] Poulsen F， Jensen K B.A luminescent oxygen channeling immunoassay for the determination of insulin in human plasma[J]. Journal of Biomolecular Screening，2007，12（2）：240-247.

[4] 王开森，杨道理，尹秋霞，等.血清tPSA水平在前列腺疾病中的应用价值[J]. 放射免疫学杂志，2008（1）：41-42.

[5] 邹丽萍，贺安，林冠峰，等.总PSA光激化学发光免疫分析法的建立[J].现代免疫学杂志，2011，31（6）：462-465.

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[7] Schneider S，Chen H，Tang J，et al. Development of a homogeneous AlphaLISA ubiquitination assay using ubiquitin binding matrices as universal components for the detection of ubiquitinated proteins[J]. Biochimica et Biophysica Acta， 2012，1823 （11） ：2038-2045.

[8] Waller H， Chatterji U， Gallay P， et al. The use of AlphaLISA technology to detect interaction between hepatitis C virus-encoded NS5A and cyclophilin A [J]. Journal of Virological Methods ， 2010，165 （2）：202-210.

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[11] 甘星，王颖，宋娟，等.甲型肝炎病毒IgM AlphaLISA检测方法的初步建立[J].中华实验和临床病毒学杂志，2012，26（2）：139-141.

[12] Rose C， Peoch K， Chasseigneaux S，et al. New highly sensitive rodent and human tests for soluble amyloid precursor protein alpha quantif i cation： preclinical and clinical applications in Alzheimer’s disease[J].BMC Neuroscience， 2012，13： 1471.

Research progress on amplif i ed luminescent proximity homogeneous assay linked immunosorbent assay

Zhang Cunliang1，2， Nie Fuping2，3， Wang Yu2，3， Yang Jun2， Li Yingguo2， Cai Jiali1
（1 Chongqing University of Technology， Chongqing Nan an 400000； 2 Chongqing Inspection and Quarantine Bureau Technology Center， Chongqing Jiang bei 400020； 3 Chongqing University， Chongqing Sha ping ba 400030）

The new technology of amplif i ed luminescent proximity homogeneous assay linked immunosorbent assay is based on the development of luminescent oxygen channeling immunoassay technology， and it is characterized with more sensitivity、homogeneity、low back ground、no-wash and less sample size. The technology has been used in the detection of biomarkers、kinases、antigens、antibodies、protein-protein interactions and in the research of Highthroughput screening and disease diagnosis. The technology will be applied and developed in more regions with progress in science.

AlphaLISA； detection； development

R446.6

：A

：1005-944X（2014）03-0046-03

国家质检总局科技项目（2010IK023），（2012IK028）

聂福平，蔡家利