弯曲菌荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

（扬州大学，江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009）

弯曲菌荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

朱佳琪，张小燕，黄金林，焦新安

（扬州大学，江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009）

根据弯曲菌16S rRNA基因的靶序列设计特异性引物和探针，对反应条件和试剂浓度进行优化，建立了快速检测鸡肉中弯曲菌的荧光定量PCR方法，并对其特异性、敏感性和重复性进行评价。该方法除了对弯曲菌有扩增曲线外，对其他常见食源性病原菌均未有扩增曲线，具有较好的特异性；弯曲菌的最低检测限为10 CFU/ mL；重复性实验获得标准曲线相关系数为R2=0.999，批内可重复性变异系数在0.12%-2.1%之间，批间可重复性变异系数为1.7%。应用该方法对68份鸡肉样品检测弯曲菌阳性率为95.6%（65/68），传统分离方法阳性率为89.5%（60/68），两种方法的阳性符合率为89.7%。本研究建立的荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性好、操作简单，大大缩短检测周期，可作为检测鸡肉样品中弯曲菌的手段，为鸡肉样品弯曲菌的流行病学调查研究提供新的工具。

弯曲菌；16S rRNA基因；荧光定量PCR

弯曲菌是近年来日益受到国内外学者重视的一种人兽共患病原菌，可引起急性腹泻和食物中毒，是导致成人和儿童腹泻的重要病原菌，也是世界范围内广泛流行的人畜共患致病菌[1-2]。在中国弯曲菌引起的腹泻与沙门氏菌引起的腹泻同样常见，上海、北京等地多次报道因食用污染食物感染弯曲菌并引发疾病[3]。大量的流行病学研究表明，处理或消费未煮熟鸡肉是人感染弯曲菌病的主要途径[4]，

减少或消除食物链尤其是禽类食品中弯曲菌是控制该病的主要策略，因此建立灵敏准确的弯曲菌检测方法对预防和控制鸡肉中弯曲菌具有重要作用。

传统基于培养方法的弯曲菌检测包括增菌、分离和鉴定，大概需要5-6天时间[5-6]。尤其是弯曲菌有可能处于活的不可培养（VBNC）状态，这种状态的细菌对人具有致病隐患但培养方法却很难检测出[7]。随着基因组测序、在线数据库和生物信息学分析的不断完善，一些基于核酸的方法尤其是PCR方法已成为病原菌检测的快速有效手段[8-9]。普通PCR存在着操作步骤繁琐、容易造成污染、难以准确定量检测等不足，而荧光定量PCR方法是在传统PCR基础上发展起来的分子生物学检测技术，因重复性好、特异性强、敏感性高和易操作等优点，已成为检测领域中一种重要的快速检测手段[10]。

本研究针对弯曲菌的16S rRNA基因设计引物和探针，建立了一种快速检测弯曲菌的实时荧光定量PCR方法，其重复性和特异性较好，提高了检测的准确性及缩短检测时间，为鸡肉样品中弯曲菌的流行病学调查研究及风险监测提供新手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 空肠弯曲菌（NCTC11168、ATCC33560）、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、粪链球菌、副溶血性弧菌、奇异变形杆菌、单增李斯特菌等菌株由扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室保存。

1.1.2 主要仪器与试剂 荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品（ABI PRISM 7500 Real-time PCR System）；Premix Ex TaqTM（ Perfect Real Time）（DRR039A）试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物和探针的设计与合成 根据Gene-Bank公布的16S rRNA的基因序列（GenBank accession Y19244），应用Primer Premier 5.0软件设计了特异性引物和探针，其序列为：上游引物5’- GATTATCAAGTCTCTTGTGA -3’，下游引物5’- ATGGGTATTCTTGGTGATA -3’，荧光探针5’-（FAM）ACCACCAATTCCATCTGCCTCT（Eclipse）-3’，引物和探针均由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.2.2 模板DNA制备 采用热煮沸法，吸取菌悬液1 mL以200 g离心5 min，重复3次，吸取上清，以9000 g离心3 min，重复3次，最后以蒸馏水悬浮，隔水煮沸20 min，取出立即置于冰上，9000 g离心5 min，所得上清液即为所述弯曲菌DNA样品。

1.2.3 荧光定量PCR扩增体系及条件优化 分别对荧光定量PCR引物和探针浓度、模板浓度、退火温度进行筛选优化。反应体系为20μL，其中Premix Ex Taq（2× DRR039A）10μL，上下游引物各0.4μL，Probe 0.5μL，DNA模板2μL，50×ROX Reference DyeⅡ0.4μL，去离子水补至20μL。优化后反应条件为：95℃30 s；95℃5s，60℃34 s，40个循环；60℃测定荧光值。

1.2.4 荧光定量PCR检测方法的特性评价

1.2.4.1 标准曲线的制备 将ATCC33560培养物悬于生理盐水中，洗涤2遍，重新悬于1mL生理盐水，充分混匀，并进行10倍梯度稀释，得到2×104-2×108CFU/mL 5个梯度的培养物；按1.4方法提取细菌基因组DNA，进行荧光定量PCR扩增，得到相应的动力学曲线，并计算产生相应的标准曲线。

1.2.4.2 特异性试验 将空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、粪链球菌、副溶血性弧菌、奇异变形杆菌、单增李斯特菌等菌株制备成一定浓度的菌悬液，同时准备经标准方法检测为阴性的样品，用优化的荧光定量PCR方法进行检测，评估该方法的特异性

1.2.4.3 灵敏性试验 将ATCC33560弯曲菌培养物洗涤2遍，重新悬于1mL生理盐水中，充分混匀，并进行10倍梯度稀释，得到1×100-1×106CFU/ mL 7个梯度的培养物；按1.2.2方法提取细菌基因组DNA，并用荧光定量 PCR方法检测这7个稀释度的弯曲菌DNA，确定其灵敏性。

1.2.4.4 重复性试验 批内可重复性评价：将ATCC33560弯曲菌经6次倍比稀释，每个浓度重

复2次，观察Ct值之间的误差；批间可重复性评价：将NCTC11168，ATCC33560两株弯曲菌分别经6次倍比稀释，每个浓度重复2次，进行荧光定量PCR扩增。

1.2.4.5 荧光定量PCR方法与平板计数法的比较将ATCC33560培养物悬于生理盐水中，洗涤2遍，重新悬于1mL生理盐水中，充分混匀，并进行10倍梯度稀释，得到101-103CFU/mL 3个梯度培养物 ；用荧光定量 PCR方法检测该 3个稀释度的弯曲菌DNA，同时取100 μL菌悬液涂于无抗CCDA平板，42±1℃微需氧条件下培养后菌落计数，本实验重复5次。

1.2.5 鸡肉样品检测

1.2.5.1 样品采集 采集扬州市某一活禽市场生鲜鸡肉胴体样品68份，采样方法参考美国农业部食品安全检查署（ FSIS）HACCP法。使用含PBS的棉球均匀地擦拭禽肉内外表面（先擦拭外表面250cm2，后擦拭内表面250cm2，共计500cm2），将擦拭好的棉球置于采样袋内，并将样品置于冰盒中，4h内运送至实验室进行检测。

1.2.5.2 样品处理 挤出无菌棉球中的PBS置于指形管中，分别取100μL按1.2.2方法提取细菌基因组DNA备用，同时取100μL直接涂抹CCDA平板，42±1℃微需氧条件培养分离细菌。

1.2.5.3 荧光定量PCR方法检测 将获得的细菌基因组DNA作为模板，进行荧光定量PCR扩增。

1.2.5.4 菌株分离纯化和鉴定 将CCDA平板上的疑似菌落经纯化培养后制备菌落DNA模板，经多重PCR方法（参照何蕊等[11]）和国标方法（参照GB/T 4789.9-2008[12]）进行鉴定。

2 结果

2.1 标准曲线的制备

用弯曲菌16S rRNA基因进行荧光定量PCR扩增，获得1条标准曲线，该曲线的斜率为-3.286，截距为40.878（图2），横坐标为细菌数量，纵坐标为循环阈值Ct。从标准曲线得出细菌数x与循环阈值Ct之间的线性关系曲线表达式为Ct=-3.286x+40.878，根据该表达式测算出所测样中细菌数。由标准曲线可知，所建立的荧光定量PCR方法相关系数R2=0.999，表明该方法误差较小，符合弯曲菌检测要求。

图1弯曲菌real-time PCR标准曲线

2.2 特异性评价结果

如图2所示，空肠弯曲菌和结肠弯曲菌均能特异性出现S型扩增曲线，而非弯曲菌的其他肠道细菌及阴性样品均无反应扩增曲线，表明此方法的特异性较好。

图2弯曲菌real-time PCR特异性扩增曲线

2.3 灵敏性评价结果

稀释至相应浓度细菌量的基因组DNA分别取2μL进行荧光定量PCR，结果表明荧光定量PCR最低检测限为10 CFU/mL（表1）。

表1弯曲菌探针荧光定量PCR灵敏性检测

2.4 重复性评价结果

2.4.1 批内可重复性结果 将ATCC33560经6次倍比稀释，每一个浓度重复2次，其荧光定量PCR结果见表2，结果显示变异系数在0.12%-2.1%之间，说明可重复性较好。

2.4.2 批间可重复性评价 分别将NCTC11168、ATCC33560两株弯曲菌进行real-time PCR检测，

其检测结果见表3，批间变异系数为1.7%，说明可重复性较好。

表2荧光定量PCR批内重复性检测结果

表3荧光定量PCR批间重复性检测结果

2.5 荧光定量PCR检测方法与平板计数法的比较

图3探针荧光定量PCR与平板计数方法的比较

2.6 鸡肉样品检测结果

将扬州某农贸市场采集的68份鸡肉样品分别用荧光定量PCR方法和平板计数方法进行弯曲菌的检测，结果显示利用本研究建立的荧光定量PCR方法其检测阳性率为95.6%（65/68），传统分离方法阳性率为89.5%（60/68），灵敏性高于平板计数法，两种方法的阳性符合率为89.7%。

3 讨论

在分子生物学技术领域，荧光定量PCR技术以其敏感性高、特异性强的特点使得它在检测病原菌中具有其他检测方法无可比拟的优越性，已被用于各种来源病原体的诊断，包括人类粪便[13-14]、食品、家禽、牛奶、水[15]以及环境样品[16-17]等。弯曲菌作为一种重要的食源性病原菌已日益成为食品卫生行业监测的重点，为了能了解食品中弯曲菌的污染状况，很多学者已在这方面做了大量的工作，许多分子生物学手段也已经被运用于弯曲菌检测中，但目前还没有一个国际公认的快速检测弯曲菌的标准方法。建立弯曲菌快速而特异的检测方法，是有效控制和预防弯曲菌的关键所在。

本研究所建立的荧光定量PCR检测方法能准确检测出鸡肉样品中弯曲菌的污染量，在101-108CFU/mL范围内具有良好的线性关系，其扩增效率为0.999；该方法还具有高度特异性，其它相关的肠道食源性致病菌包括金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠埃希氏菌、粪链球菌、副溶血性弧菌、奇异变形杆菌、单增李斯特菌经实时PCR扩增后均无特异性扩增曲线；弯曲菌传统培养法检测限为104CFU/mL，全过程至少需5-6天，而本方法仅需1小时，敏感度可检测到10 CFU/mL；批内和批间重复性试验变异系数均很低，确保该方法随着时间的推移其在定量上的可靠性和正确性。通过对鸡肉样品的检测，荧光定量PCR方法与分离培养方法两者的符合度为89.7%，荧光定量PCR法对样品检测的灵敏度大于分离培养，造成这种差别的原因可能是样品中弯曲菌处于VBNC状态或者样品中有活力的弯曲菌数太少以至于培养方法不能分离得到，而荧光定量PCR对于处于这种状态的弯曲菌同样具有检测的能力，可以有效地反映出样品中弯曲菌的携带情况。

综上所述，本研究建立的弯曲菌荧光定量PCR检测方法具有足够的灵敏度与准确性，适用于鸡肉样品中弯曲菌的快速检测，为鸡肉样品中弯曲菌危害因子的风险监测和风险评估提供了新的手段。

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Development and Application of Real-time PCR Assay for Quantitative Detection of Campylobacter spp

Zhu Jiaqi，Zhang Xiaoyan，Huang Jinlin，Jiao Xinan

（1. Jiangsu Key Lab of Zoonosis/Jiangsu Co-Innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009）

To establish a rapid assay for quantitative detection of Campylobacter spp.，a pair of primers and fuorescent probe were designed according to 16S rRNA sequence of Campylobacter spp.，and then a real-time PCR method was successfully established to detect Campylobacter spp. Results demonstrated that the method was specifc for amplifcation of Campylobacter spp.，but no amplifcation for other related bacteria. The detection limit of the assay was 10CFU/mL and the correlation coeffcient of standard curve（R2）was 0.999. The detection of 68 chicken meat samples showed that the positive rate was 95.6%，while the positive rate was 89.5% by traditional culture method. The method was simple，rapid，specifc and sensitive for rapid detection of Campylobacter spp. and a new tool for epidemiological investigation of Campylobacter spp. in chicken meats.

Campylobacter spp.；16S rRNA gene；real-time PCR

S8562.613；TS207.4

：A

：1005-944X（2014）12-0070-05

国家自然科学基金（31372449）、国家科技支撑计划（2014BAD13B02）、江苏高校优势学校建设工程项目、江苏省普通高校研究生科研创新计划项目（CXLX13-922）资助

黄金林