猪流行性腹泻病毒双抗夹心ELISA的建立

雷 利，彭 姣，祁振强，秦智峰，卢 超

（1.深圳市宝舜泰生物医药股份有限公司，广东深圳 518057；

2.深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，广东深圳 518045）

猪流行性腹泻病毒双抗夹心ELISA的建立

雷 利1，彭 姣1，祁振强1，秦智峰2，卢 超1

（1.深圳市宝舜泰生物医药股份有限公司，广东深圳 518057；

2.深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，广东深圳 518045）

用猪流行性腹泻病毒（PEDV）免疫蛋鸡后提取抗猪流行性腹泻病毒的特异性卵黄抗体为捕获抗体，鼠抗猪流行性腹泻病毒多克隆抗体为检测抗体，建立了猪流行性腹泻病毒病原检测的双抗夹心ELISA，其最适包被抗体浓度为1∶4000（12.35µg/mL），鼠抗猪流行性腹泻病毒的多克隆抗体最佳浓度为1∶6000（10.25µg/ mL），样品反应时间为30min，酶标抗体工作浓度为1∶6000，并以OD450≥0.130作为阳性判断标准。该方法与猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒、猪流感病毒、大肠杆菌K88、K99、987P、F41等病原无交叉反应。对经猪流行性腹泻病毒PCR检测的100份粪便样本进行检测表明，8份PCR检测阳性样本中6份为本法阳性；PCR阴性者本法全部阴性。实验结果表明该方法具有良好的特异性和敏感性，可用于猪流行性腹泻病毒的快速检测。

猪流行性腹泻病毒；卵黄抗体；双抗夹心ELISA

猪流行性腹泻病毒为冠状病毒科的成员[1]，仔猪有较高的发病率和死亡率[2]，给某些养猪场带来严重的经济损失。本实验用一株猪流行性腹泻病毒分离株，制备免疫原免疫产蛋鸡，收集高效卵黄，分离提纯纯化制备成特异性抗体；用酶联免疫双抗夹心法检测猪呕吐物及粪便中的腹泻病毒病原[3]，及早发现感染猪流行性腹泻病毒的猪只，提前进行治疗并对猪场所有猪只进行健康监控[4]。

1 材料和方法

1.1 材料

酶标板：Costar公司可拆卸酶标板；PEDV特异性卵黄抗体：PEDV毒株（深圳出入境动植

物检验检疫中心自行分离）免疫产蛋鸡，提取含抗PEDV病毒的蛋黄，通过硫酸铵沉淀法粗提抗PEDV卵黄抗体，再经M蛋白进行亲和层析纯化（实验室制备）；鼠抗PEDV多克隆抗体：用PEDV毒株免疫小鼠，采集眼睛血液，离心后取血清，进行纯化；酶标二抗：购自Sigma公司；阴阳性样本均由深圳出入境动植物检验检疫中心提供，阴阳性样本的稀释度均为1∶10。

1.2 PEDV-IgY特异性卵黄抗体最佳浓度测定

用包被液将PEDV-IgY特异性抗体按不同稀释倍数进行稀释，按照ELISA程序进行测定，比较样本的OD450值，P/N值最大的确定为最佳包被浓度。

1.3 多克隆抗体最佳稀释度的确定

将PEDV-IgY特异性抗体按确定的最佳浓度进行包被，再将纯化的鼠抗PRDV-IgG多克隆抗体按不同倍数稀释，按照ELISA程序进行测定，比较样本的OD450值，P/N值最大的确定为最佳多抗稀释浓度。

1.4 最佳封闭液的选择

用5%的脱脂奶粉、酪蛋白钠、5%胎牛血清、1%BSA、鱼明胶作封闭液，酶标仪上读出OD450值，比较阴阳性样本的OD450值，确定最佳封闭液。

1.5 酶标二抗最佳稀释度的选择

将多克隆抗体按最佳浓度稀释后，加入不同浓度的倍比稀释的HRP-羊抗鼠IgG，按照ELISA程序进行测定，比较样本的OD450值，确定酶标二抗的最适工作浓度。

1.6 血清作用时间和酶标二抗作用时间确定

由以上试验确定好包被浓度，多抗及酶标二抗浓度，37 ℃分别作用不同时间，按照ELISA程序进行测定，比较样本的OD450值，确定最佳反应时间。

1.7 阴阳临界值的确定

按已建立的双抗体夹心ELISA方法，检测20份阴性血清，每份设三个重复。计算出阴性血清OD450平均值（X）和标准差（S），以X+3S的值为阴性和阳性的临界值。

1.8 特异性检测

用ELISA方法对本实验室保存的猪传染性胃肠炎病毒抗原、猪轮状病毒抗原、猪流感病毒抗原、产肠毒素大肠杆菌K88，K99、987P、F41抗原发生交叉反应，及由深圳出入境动植物检验检疫中心提供的20份阴性血清进行特异性鉴定，并用PEDV抗原作阳性对照，

1.9 临床样本检测

用来自比利美英伟营养有限公司恩平试验中心经PCR所检测过的100份样本，其中PCR检测有8份为阳性的样本中用本实验室建立的双抗体夹心ELISA方法进行检测（实验结果另文公布），有6份相同编号的样本检测为阳性，其它样本全部检测为阴性。

1.10 敏感性实验

结合阴阳临界值判定，建立的双抗体夹心ELISA方法的敏感性为105（55.930 ng/mL）

2 结果

2.1 PEDV-IgY特异性卵黄抗体最佳浓度的测定当包被浓度为1∶4000（12.35µg/mL）时，P/N值最大（表1），故将此确定为包被浓度。

表1抗体最适稀释浓度确定

2.2 多抗最佳稀释度浓度的确定

当多抗浓度为1∶1000（10.25µg/mL）时，P/N值最高（表2），故将此确定为多抗最佳浓度。

表2多克隆抗体最适稀释度确定

2.3 最佳封闭液选择

用鱼明胶作封闭液时，P/N值最大（表3），故选鱼明胶为最佳封闭液。

表3最佳封闭液的确定

表4酶标二抗最佳浓度确定

表5样本最佳反应时间的确定

表6阴阳临界值的确定

表7特异性实验结果

2.4 酶标二抗最佳浓度

当酶标二抗作6000倍稀释时，P/N值最高（表4），故确定此浓度为最佳二抗浓度。

2.5 样本最佳反应时间确定

当样本作用时间为0.5h时，阳性对照OD值为1.020，接近1.0，阴性对照OD值较低，本底也较低，P/N值最大（表5），故样本作用时间确定为0.5h。

2.6 阴阳临界值的确定

按照已建立的双抗体夹心ELISA方法检测10份阴性样本，计算其OD450的平均值及标准方差，阴阳性临界值= X +3SD。经计算，阴阳性临界值=0.08427+3×0.015252=0.130 因此把临界值定为0.130。在阴阳对照成立的情况下，OD450大于0.130就可以判定猪流行性腹泻病毒抗原阳性，否则，判为阴性（表6）。

2.7 特异性试验

PEDV只与PEDV抗原发生反应，而不与猪传染性胃肠炎抗原、猪轮状病毒抗原、猪流感病毒抗抗原、产肠毒素大肠杆菌K88，K99、987P、F41抗原发生交叉反应，另有20份阴性血清均不产生反应，说明建立的双抗体夹心ELISA方法特异性好。

2.8 敏感性试验

如表8所示，结合阴阳临界值判定，建立的双抗体夹心ELISA方法的敏感性为105（55.930 ng/mL）。

2.9 临床样本检测

由试验确定的阴阳临界值为0.130，阴阳对照和空白对照成立，用来自比利美英伟营养有限公司恩平试验中心经PEDV-PCR所检测过的100份样本，其中PCR检测有8份为阳性的样本中用本实验室建立的双抗体夹心ELISA方法进行检测（检验结果将另文公布），有6份相同

编号的样本检测为阳性（表9）。

表8敏感性试验结果

表9双抗体夹心ELISA法检测不同样品的抗原

3 讨论

猪流行性腹泻病（PED）是由PEDV引起的一种高度接触性肠道传染病，发病特征为呕吐、水样腹泻、脱水，对仔猪具有高效致病率[5]。在自然情况下，PEDV对不同年龄阶段猪群都易感，其中7日龄以内的哺乳仔猪多发死亡率高[6]。PEDV与猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）同属冠状病毒属成员，二者在病毒粒子形态、临床症状及流行病学方面极为相似，难以区分[7]；而且早些年对此病的实验室诊断主要是采用免疫电镜法、PCR、直接免疫荧光法、微量血清中和试验等[8-9]，但是这些方法对实验室基础条件及仪器要求较高，不能普遍使用。本研究采用酶联免疫双抗夹心法检测，检测结果准确、灵敏度高，具有广泛应用前景。

卵黄抗体（IgY）是用抗原免疫蛋鸡后产生的免疫球蛋白由血液转入卵黄中形成的[10]，其化学性质稳定、产量高、成本低，具有开发功能性食品和新药的潜能。目前IgY主要用于疾病诊断检测和防治[11]、食品添加剂及化妆品领域等。而卵黄抗体作为一种高效的生物活性免疫球蛋白，能对一种疾病更好的进行监测。目前用卵黄抗体研制成防治仔猪腹泻病毒药物的研究较多[12]，但卵黄抗体在双抗夹心用作包被抗体检测抗原的研究较少，所以本实验中利用卵黄抗体这一特异进行疾病的抗原检测，检测病毒能早日对猪只情况进行监控及早日治疗。

此实验选择PEDV IgY特异性抗体作为第一抗体包被96孔酶标板来捕获样品中的抗原，用多克隆抗体作为第二抗体，因为这种特异性抗体可以针对单一抗原决定簇，具有表位特异性，先用PEDV-IgY特异性卵黄抗体包被酶标板，特异性的捕获PEDV抗原，再加入鼠抗PEDV-IgY多克隆抗体，增加了该方法的特异性[13]。通过对ELISA实验中各项条件的优化，本试验确定了最佳抗体包被浓度1∶4000，多抗最佳稀释浓度1：6000，最佳封闭液为鱼明胶、酶标二抗最佳浓度为1：6000、样本最佳反应时间0.5h，显色时间（37℃，10min）和阴阳临界值（OD450≥0.13为阳性），有效降低

了非特异性反应，保证了检测方法的准确性和灵敏性。用所建立方法对传染性胃肠炎抗原、猪轮状病毒抗原、猪流感抗原抗原、产肠毒素大肠杆菌K88，K99、987P、F41抗原进行交叉反应，均为阴性，证实该方法具有较好的特异性、敏感性和重复性，可以用于PEDV抗体的检测和相关流行病学调查。

用来自比利美英伟营养有限公司恩平试验中心经PEDV-PCR所检测过的100份样本，在PCR检测8份阳性样本中，有6份用本实验室建立的双抗体夹心ELISA方法检测阳性，符合率可达96%。双抗体夹心ELISA方法已被大量用于动物疫病的临床诊断，但目前还没有查到与此方法相同的文献，报道的大多是抗体检测，不利于早期发现病毒感染。本研究建立的PEDV抗体夹心ELISA方法弥补了现有PEDV检测方法的不足，用本研究建立的夹心ELISA法检测PEDV抗原非常方便，直接采用粪便、呕吐物均可作为临床样品进行检测。

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Development of a Double Antiby Sandwich ELISA for Detection of Porcine Epidemic Diarrhea Virus

Lei Li1，Peng Jiao1，Qi Zhenqiang1，Qin Zhifeng2，Lu Chao1

（1.Shenzhen Boostie Biological Pharmaceutical CO. ，LTD，Shenzhen，Guangdong 518057；2. Animal & Plant Inspection and Quarantine Technology Center，Shenzhen Enter-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shenzhen，Guangdong 518103）

Porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）was used to immunize laying hens for preparation of specifc yolk antibody（IgY）as capturing antibody. A double antibody sandwich ELISA（DAS-ELISA）was developed for the detection of PEDV in pigs. The optimal coating concentration of anti-PEDV IgY was 1∶4000（12.35µg/mL）；the optimal concentration of mouse-anti-PEDV polyclonal antibody was 1∶6000（10.25µg/mL）；optimal reaction time was 30 minutes；optimal working concentration of HRP-labelled goat-anti-mouse IgG was 1∶6000；and the positive standard value was OD450≥0.130. The DAS-ELISA showed no cross-reaction with porcine transmissible gastroenteritis virus，porcine rotavirus，Escherichia coli k88/k99/987P/F41. One hundred clinical fecal samples which had been detected by real-time PCR were analyzed by this method. 6 out of 8 real-time PCR positive samples were positive in the DASELISA，and all the negative samples in real-time PCR were negative in the DAS-ELISA. The results indicated that the DAS-ELISA was highly specifc，reproducible and sensitive，and suitable for rapid detection of PEDV.

porcine epidemic diarrhea virus（ PEDV）；IgY；double antibody sandwich ELIS

S852.65

：A

：1005-944X（2014）12-0065-05

深圳市科创委技术创新计划专项基金资助项目，No. CXZZ20130320154210829