马泰勒虫二温式PCR检测方法的建立及应用

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（1.新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052；2.伊犁出入境检验检疫局，伊宁835000）

马泰勒虫二温式PCR检测方法的建立及应用

李佳1，李永畅1，王振宝2，张杨1，巴音查汗1

（1.新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052；2.伊犁出入境检验检疫局，伊宁835000）

为给马泰勒虫提供特异、快速、敏感的检测方法，根据马泰勒虫18S rRNA保守基因序列，设计了一对特异性引物，建立马泰勒虫二温式PCR检测方法。扩增出的目的片段大小为139 bp，经克隆、测序分析，与GenBank上登录的序列相似性为100%。该方法与其他虫种无交叉反应，具有一定的灵敏性和特异性。应用所建立的方法对采集的30份疑似病例全血样品进行检测，阳性率为33.3%，相比之下相同样品的血液涂片检查的阳性率为13.3%。与三温PCR方法比较减少了反应时间的消耗，提高了检测效率，该方法对马泰勒虫病的早期（潜伏感染期）检测、诊断具有实际应用价值。

马泰勒虫；18S rRNA；二温式PCR；检测

马泰勒虫（Theileriaequi）是由媒介蜱传播的一种血液寄生虫，主要感染马属动物红细胞，潜伏期可达24天，在临床上主要表现为高热、黄疸、贫血、淋巴结肿大等症状[1]，如不及早诊断和及时治疗极易导致死亡，严重影响马产业的发展。该病具有一定的季节性和区域性。我国主要马产区均有该病发生的报道[2]，我们实验室遇到的病例亦很普遍。由于马泰勒虫病危害大，不容易根治，对国际贸易产生很大影响，因此世界动物卫生组织（OIE）将马泰勒虫病列为重要动物疾病，我国将其列为二类病[3]。近年来该病呈上升趋势，我国从国外引进优良马匹也有所增加，为防止马泰勒虫病的传入、传出，马泰勒虫病检验检疫工作尤为关键。本研究依据PCR技术原理[4-5]，建立了二温式PCR检测方法，该方法比传统的血液涂片方法要快速、灵敏，与三温PCR相比较，缩短了反应时间，提高了检测效率。该方法的建立，为马泰勒虫病的流行病学调查及疫病监控提供简便、快捷、高效的检测方法。

1 材料与方法

1.1 虫株与检测样品

马泰勒虫、驽巴贝斯虫、环形泰勒虫、牛巴贝斯虫均由本实验室保存；临床疑似病例样品采自新疆伊犁昭苏县，共30份抗凝全血。

1.2 主要试剂及仪器

全血DNA提取试剂盒（DNA Mini Kit）购自QIAGEN公司；Taq DNA聚合酶、MgCl2、dNTPs、DL2000 Marker、pXT19-T载体、胶回收试 剂 盒（MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0）、质粒小量提取试剂盒（Mini BEST Plasmid Purifcation Kit Ver.3.0）等均购自宝生物工程（大连）有限公司；NANODROP 2000c、TProfessional PCR仪购自Thermo公司。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank上登录的马泰勒虫18S rRNA基因序列，利用Primer Premier 6.0和Oligo软件设计一对引物（T.e-F：5’-TTGCGGTGTTTCGGTGA-3’；T.e-R：5’-TCTCCGGAATCGAACCC-3’），目的片段大小为139 bp，由北京鼎国生物技术有限公司合成。

1.4 马泰勒虫DNA的提取

将临床症状为马泰勒虫病，且经血液涂片染色镜检为阳性的马泰勒虫病的抗凝血，按照全血基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，用紫外分光光度仪测DNA的含量，置 20℃保存。

1.5 二温式PCR反应体系及条件优化

PCR反应在25μL体系中进行，对影响PCR反应的主要参数Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度和退火温度进行优化。

1.6 阳性标准品制备

使用胶回收试剂盒将PCR产物回收和纯化，将回收的PCR产物与pXT19-T 载体连接，转化至感受态细胞E.coliDH5α，经蓝白斑筛选，挑取白色单菌落接种于含氨苄青霉素LB培养液中培养，提取质粒进行PCR鉴定，将鉴定为阳性的质粒送北京鼎国生物技术有限公司测序鉴定。

1.7 特异性试验

以马泰勒虫基因组DNA为试验样本，同环形泰勒虫、牛巴贝斯虫、驽巴贝斯虫基因组DNA为对照样本，按照最佳退火温度进行PCR反应，检验其特异性。

1.8 敏感性试验

对所提取的马泰勒虫DNA用紫外分光光度计测定DNA的浓度，对该模板进行10倍系列稀释，使用最佳反应条件进行二温式PCR扩增，确定反应体系的敏感性。

1.9 样品检测

使用建立的方法对采自新疆伊犁的30份疑似病例样品进行检测，并与血液涂片染色进行镜检进行比较。

2 结果

2.1 PCR反应体系及反应条件的优化

通过对二温式PCR反应体系及反应条件的优化，最终确定的最佳反应体系为（25 μL）：10 ×PCR buffer 2.5 μL，MgCl2（25 mmol）2 μL，dNTPs（2.5 mmol）2 μL，上下游引物（10 μmol）各1 μL，Taq DNA 聚合酶（5 u/μL）0.2 μL，模板DNA 1 μL，加灭菌ddH2O至25 μL。最佳反应条件：94℃预变性3 min；95℃ 15s，61℃ 45s，40个循环；61℃延伸5min。PCR产物进行12 g/L琼脂糖凝胶电泳，扩增出条带大小为139bp的电泳条带，与预期设计的目的片段大小相符（图1）。

图1 PCR反应体系及循环条件的优化

2.2 重组质粒的鉴定结果

将提取的质粒进行二温式PCR扩增，得到一条与预期大小一致的特异性片段，将鉴定为阳性的重组质粒送北京鼎国生物技术有限公司测序，经DNA Star软件分析比对，PCR产物序列与参照序列（GenBank录号为EU462510）相似性达100%（图2）。

图2 PCR扩增产物测序结果

2.3 特异性试验

使用优化的二温式PCR方法，分别通过对马泰勒虫、驽巴贝斯虫、牛环形泰勒虫、牛巴贝斯虫核酸样品进行扩增，结果显示只有马泰勒虫在139 bp处有条带出现（图3），而其他样品均无条带出现，说明该方法对马泰勒虫具有特异性。

图3特异性试验结果

2.4 敏感性试验

对所提取的马泰勒虫DNA，使用紫外分光光度仪测定DNA的含量，计算DNA的浓度（原始浓度为38 ng/μL），然后以10倍系列稀释进行二温式PCR进行扩增，凝胶电泳结果显示在样品稀释107倍时还有可见的条带（图4），说明检测最低含量为38 fg。

图4敏感性试验结果

2.5 临床样品检测

通过对采自新疆伊犁新源县30份全血分别使用所建立的二温式PCR方法和血液涂片检测。结果二温式PCR的阳性检出率为33.3%，血液涂片阳性检出率为13.3%，且通过血液涂片检测出的阳性，PCR检测均为阳性；部分血液涂片检测出的阴性，通过建立的PCR方法检测为阳性。说明所建立的二温式PCR 方法比传统的血液涂片镜检方法更敏感，可用于马泰勒虫病的早期及隐性感染病例的检测。

3 讨论

本研究依据常规PCR基本原理，将退火和延伸温度合二为一而建立了二温式PCR。对比二温式PCR 与常规PCR检测方法，二者在检测的敏感性方面无显著差异，但二温式PCR的退火和延伸过程是在同一温度下进行，其最佳温度为61℃，使引物与模板能准确结合而且稳定性好，以减少非特异扩增[6-7]，在整个循环中只有两个温度变化，操作上较常规三温式PCR更为简单，还可缩短操作时间，使对病原的检测更省时、快捷，此方法可以应用于流行病学调查和大量临床样品检测。

该方法还可避免血清学（免疫学方法）方法检测的假阳性。当马匹感染虫体后，机体产生抗体（经治疗将体内虫体杀死，其抗体水平可持续一段时间），通过血清学检测会造成假阳性的检测结果[8]。

该方法比传统的血液涂片方法要快捷、检出率高的特点。血液涂片染色镜检结果易受到很多因素的影响，如处于带虫状态的隐性感染，并无明显症状的马匹或操作不当及使用较差等显微镜等情况下发现虫体是很困难的[9]。

本实验，对采自的疑似病例马匹30份样品进行了血液涂片染色镜检（阳性率为13.3%）的同时，使用所建立的二温式PCR检测方法进行了检样（阳性检出率为33.3%），结果表明二温PCR检测方法比血涂片检测方法更特异、更敏感，更适合于本病的早期诊断、隐性感染和流行病学调查研究。

[1] 罗金.马泰勒虫分类学定位佐证及PCR、ELISA检测方法的建立[D].兰州：甘肃农业大学，2011：1-8.

[2] Xuan X， Bayin C， Huang X， et al.Diagnosis of equine piroplasmosis in Xinjiang province of China by the enzymelinked immunosorbent assays using recombinant antigens[J]. Veterinary Parasitology， 2002，108（2）：179-182.

[3] 中华人民共和国出入境动植物检疫条约集[G].北京：中华人民共和国国家出入境检验检疫局，2000：4-4.

[4] 熊焕章，刘冰，张守发.马巴贝斯虫PCR检测方法的建立及应用[J].延边大学农学学报， 2007， 29（2）：129-133.

[5] Rampersad J，Cesar E，Campbell M D，et al. A field evaluation of PCR for the routine detection of Babesiaequi in horses[J].Veterinary Parasitology， 2003，114（2）：81-87.

[6] 董倩，黄国强，叶冰莹，等.二温式PCR在特异短核酸探针合成中的应用[J].花生学报，2008， 37（3）：5-10.

[7] 王振宝，刘启生，哈森，等.牛环形泰勒虫病二温式PCR诊断方法的建立及初步应用[J].动物医学进展，2012，33（5）：59-63.

[8] 薛书江，于龙政，曹世诺，等.驽巴贝斯虫PCR检测方法的建立及应用[J].河南农业科学， 2007（4）：106-109.

[9] 郑小龙，徐彪，王群，等.马巴贝斯虫液相芯片检测方法的初步建立[J].分析测试学报， 2012， 31：161-164.

Establishment and application of a two-temperature PCR assay for detection of Theileria equi

Li Jia1，Li Yongchang1，Wang Zhenbao2，Zhang Yang1，Bayin Chahan1
（1.College of Animal Medicine，Xinjiang Agriculture University，Urumqi， Xinjiang 830052；2.Yili Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Yining，Xinjiang 835000）

To establish a specifc， rapid and sensitive detection method for Theileria equi（T.equi）， a pair of specific primers was designed according to the conservative 18S rRNA gene sequence of T.equi and a two-temperature PCR assay for T.equi was established. The amplifed target fragment，139 bp in size was cloned and sequenced. Compared with the GenBank registered sequence，the similarity was 100% by sequence analysis.The assay showed no cross-reaction with other protozoon parasites，suggesting high specifcity. 30 whole blood samples collected were tested by the developed assay，and the positive rate of T.equi was 33.3%.While the positive rate of blood smear test was 13.3%.Compared with the three-temperature PCR assay， the reaction time was reduced and the detection effciency improved.The twotemperature PCR assay could be used for early detection and diagnosis of latent infection by T.equi with practical value.

T.equi；18S rRNA；two-temperature PCR；detec

S852.723； S858.21

：A

：1005-944X（2014）05-0078-03

国家科技支撑计划课题（2012BAD46B01-04）

巴音查汗（E-mail）bynch@hotmail.com