黄柄曲霉ASD菌株抑菌谱测定及抑菌物质初探

谢小平 刘长远 赵奎华 王 辉 关天舒 梁春浩 贾 姝 张 里

（1 沈阳农业大学植物保护学院，辽宁沈阳110866；2 辽宁省农业科学院植物保护研究所，辽宁沈阳110161）

辣椒疫病（Phytophthora capsiciLeonian）是北方设施辣椒生产上的重要土传病害，在防治上主要以化学防治为主，因化学防治存在农药残留问题，因此，生物菌剂研究已逐渐成为防治辣椒疫病的热点。黄柄曲霉（Aspergillus flavipes）属于曲霉属，研究发现黄柄曲霉对植物病害真菌有较好的抑制作用。李淑彬等（2001）从大亚湾海底沉积物中分离出1株具有广谱抗真菌作用的黄柄曲霉，对辣椒疫病菌（Phytophthora capsici）、新月弯孢霉（Curvularia lunata）、棉炭疽菌（Colletotrichum gossypii）等多种植物病原真菌有强烈抑制作用。王辉等（2012）研究表明黄柄曲霉ASD菌株对辣椒疫病有较好的防治效果，其防效优于化学药剂代森锰锌和烯酰吗啉，但对抑菌物质种类和结构未作深入研究。本试验以黄柄曲霉ASD菌株为研究对象，主要开展了抑菌谱测定和抑菌物质的提取，以期为该菌株生防菌剂研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 黄柄曲霉ASD菌株，由辽宁省农业科学院植物保护研究所园艺作物病害研究室提供。

1.1.2 供试病原菌 辣椒疫病菌、番茄晚疫病菌（Phytophthora infestans）、黄瓜蔓枯病菌（Mycosphaerella melonis）、甜瓜蔓枯病菌（Didymella bryoniae）、黄瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）、葡萄炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、葡萄灰霉病菌（Botrytis cinereaPers.）、梨轮纹病菌（Physalospora piricolaNose）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、茄子根腐病菌（Fusarium solani），均由辽宁省农业科学院植物保护研究所园艺作物病害研究室提供。

1.1.3 供试培养基 PDA 培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉12 g，蒸馏水1 000 mL。

PD 培养液：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 ASD菌株抑菌谱的测定 采用对峙培养法（Getha & Vikineswary，2002），在直径为9 cm 的PDA 平板上相距2.5 cm 的位置放置直径为0.6 cm的ASD菌饼及供试病原菌菌饼，于25℃培养4 d，测量抑菌带宽度。

1.2.2 ASD菌株的发酵培养 ASD菌株在PDA 平板上27℃培养5 d后，取菌体接种于装有100 mL PD 培养液的250 mL 三角瓶中，27℃、150 r·min-1摇床振荡培养5d（王辉，2012）。

1.2.3 ASD菌株发酵液的制备 发酵培养后的发酵原液，12 000 r·min-1离心30 min，取上清液用微孔滤膜去除菌体，即为ASD菌株的发酵液（Ji et al.，2007），采用牛津杯法检测其抑菌活性。

1.2.4 硫酸铵分段盐析条件确定 取发酵液用不同饱和度的硫酸铵（10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%）分级沉淀，4℃静止过夜后，12 000 r·min-1离心30 min 弃上清液，分别收集每一个饱和度的沉淀物（陈雪丽 等，2006）。沉淀物用少量体积的0.01 mol·L-1磷酸缓冲液（PBS）（pH 7.2）溶解，装入透析袋中，用双蒸水透析去盐并用聚乙二醇6000 包埋浓缩后即得到抑菌物质粗提物。

1.2.5 抑菌活性的测定 采用含毒介质法（全鑫 等，2010；唐琳和赵辉，2011）检测抑菌物质粗提物的抑菌活性。将抑菌物质粗提物与PDA 培养基按照1∶10的比例混合倒平板，以PDA 培养基作为对照，在平板的中心放置1个辣椒疫病菌菌饼，3次重复，置于27℃恒温培养箱培养5 d，观察辣椒疫病菌的生长情况。

1.2.6 蛋白酶对抑菌物质抑菌活性的影响 取50%硫酸铵饱和度提取的抑菌物质粗提物与按1∶1∶1的比例混合的胰蛋白酶、蛋白酶 K 和蛋白酶E 发生反应，蛋白酶浓度为1 mg·mL-1，在恒温 37℃下反应 1 h（高小宁，2012）。采用含毒介质法检测经酶解后抑菌物质粗提物的抑菌活性，以辣椒疫病菌为指示菌，每处理3次重复。

2 结果与分析

2.1 黄柄曲霉ASD菌株抑菌谱测定

由表1可知，黄柄曲霉ASD菌株对辣椒疫病菌、番茄晚疫病菌、甜瓜蔓枯病菌、黄瓜蔓枯病菌、黄瓜炭疽病菌、葡萄炭疽病菌、葡萄灰霉病菌、梨轮纹病菌、小麦赤霉病菌、茄子根腐病菌均有抑制作用，抑菌谱较广，其抑菌带的宽度为2.9～11.8 mm，其中对辣椒疫病菌、番茄晚疫病菌有较强的抑制作用（图1）。

表1 黄柄曲霉ASD菌株的抑菌谱及抑菌带宽度

图1 黄柄曲霉ASD菌株对辣椒疫病菌和番茄晚疫病菌的抑制效果

2.2 黄柄曲霉ASD菌株发酵液的抑菌活性检测

从平板抑菌活性试验可以看出，黄柄曲霉ASD菌株的发酵液对辣椒疫病菌有很强的抑菌活性，ASD菌株200 μL 发酵液对辣椒疫病菌的抑菌带宽度为7.4 mm（图2）。

图2 黄柄曲霉ASD菌株发酵液对辣椒疫病菌的抑菌活性

2.3 黄柄曲霉ASD菌株抑菌物质粗提物对辣椒疫病菌的抑制作用

试验结果显示（表2），经10%～90%饱和硫酸铵沉淀后的抑菌物质粗提物对辣椒疫病菌均有抑制活性，其中经50%饱和硫酸铵沉淀后的抑菌物质对辣椒疫病菌的抑制活性最强（图3），抑制效果达到80.78%。由此说明，经50%饱和硫酸铵沉淀的物质是具有抑菌效果的抑菌物质。

表2 经不同饱和度硫酸铵沉淀后的ASD菌株抑菌物质粗提物对辣椒疫病菌的抑制作用

图3 经50%硫酸铵饱和度沉淀的抑菌物质对辣椒疫病菌的抑菌效果

2.4 黄柄曲霉ASD菌株抑菌物质粗提物经酶解后对辣椒疫病的抑制作用

抑菌活性检测结果表明，50%硫酸铵饱和度沉淀的抑菌物质粗提物经胰蛋白酶、蛋白酶 K 和蛋白酶 E处理后，对辣椒疫病菌几乎无抑制作用，由此说明，经50%硫酸铵饱和度沉淀提取的抑菌物质为蛋白类物质。

3 结论与讨论

黄柄曲霉ASD菌株是从土壤中分离得到的，该菌对辣椒疫病具有较好的防治效果。本试验结果表明黄柄曲霉ASD菌株对多种植物病原真菌有不同程度的抑制作用，特别对辣椒疫病菌、番茄晚疫病菌有较强的抑制作用，采用硫酸铵分级沉淀的方法可得到黄柄曲霉ASD菌株的抑菌物质粗提物，50%硫酸铵饱和度沉淀出的抑菌物质粗提物对辣椒疫病菌的抑制活性最强，抑菌效果达到80.78%，并确定其为蛋白类物质。

黄柄曲霉是一种分布广泛的土壤真菌，在防治植物病害方面报道较少。该菌在代谢过程中能够产生细胞壁水解酶，抑制一些病原真菌生长（郭雷 等，2013）。蒋亭等（2002）从黄柄曲霉中分离得到7种化合物，大部分有抑菌活性；李淑彬等（2001）从海底沉积物中分离得到的黄柄曲霉可产生一种广谱抗真菌抗生素179M。本试验通过对ASD菌株抑菌物质的初步研究，明确了其具有潜在的植物病害生物防治价值。

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