脂联素对脓毒症大鼠急性肺损伤、肺毛细血管通透性的影响及机制

蔡朦朦，鲍红光，高玉洁，施 韬，韩 流，谢欣怡

(南京医科大学附属南京医院，南京市第一医院，南京210006)

目前，脓毒症已成为ICU患者死亡的重要原因之一［1］，肺脏为其最常累及的靶器官，常并发急性肺损伤(ALI)［2］，后者以肺毛细血管通透性增加、肺水肿、肺泡上皮屏障功能破坏为主要病理生理特征［3，4］。Toll样受体(TLR)4-NF-κB信号传导通路介导的失控性炎症反应是导致脓毒症ALI的主要原因［5］。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt可通过抑制NF-κB活化，下调内皮细胞中血管内皮生长因子(VEGF)介导的细胞间黏附分子(ICAM)-1及血管细胞黏附分子(VCAM)-1的表达［6，7］。本课题组前期研究［8］发现，脂联素(APN)可减轻脓毒症大鼠ALI，但具体机制尚不清楚。本研究采用盲肠结扎穿孔(CLP)法构建脓毒症动物模型，观察了APN对ALI大鼠肺毛细血管通透性的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性清洁级SD大鼠120只(由南京医科大学附属南京医院动物实验中心提供)，6～8周龄，体质量200～250 g，动物许可证号为SCXK (苏)2009-0001。基因重组APN购自北京爱迪博生物科技有限公司，伊文思蓝购自美国Sigma公司，TRIzol总RNA提取试剂购自美国Invitrogen公司，RT-PCR所需酶及其他试剂均购自美国Promega公司;VEGF、ICAM-1及VCAM-1的ELISA检测试剂盒购自美国R＆D公司;兔抗鼠Akt多克隆抗体、兔抗鼠磷酸化(p)-Akt多克隆抗体和兔抗鼠β-actin单克隆抗体购自美国Bioworld公司，Bio-Rad图像分析系统购自美国Bio-Rad公司。

1.2 动物分组、模型制备及标本采集 ①动物分组、模型制备:将120只大鼠随机分为模型组、APN干预组、APN治疗组及对照组各30只，前三组均参照文献［8］以CLP法构建脓毒症动物模型(术前禁食12 h，不限制饮水):腹腔注射2%戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉后仰卧位固定，常规消毒，沿腹正中线作一2 cm长纵行切口，以3.0丝线结扎回盲瓣下方盲肠根部，18 G穿刺针贯穿结扎端盲肠2次，并挤出少许肠内容物于腹腔，放置一条宽2 mm、两边贯通盲肠的橡皮引流条，防止肠内容物堵塞穿刺孔，将肠管回纳腹腔，逐层缝合腹部切口，术后皮下注射生理盐水2 mL/100 g补液;对照组大鼠开腹后仅分离盲肠，不结扎穿孔。其中APN干预组、治疗组分别于制模前12 h、制模后12 h腹腔注射6 mg/kg的基因重组APN，余两组分别于相同时间点腹腔注射等量生理盐水。②标本采集与处理:每组各取20只大鼠，于术后24 h处死，无菌条件下取肺组织，其中左肺上叶及左肺下叶肺组织迅速液氮速冻，右肺上叶肺组织制成10%肺组织匀浆、-80℃低温保存，用于下述指标的检测。

1.3 肺组织病理学观察及肺损伤评分 取上述操作的剩余肺组织，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，HE染色，在光镜下观察肺组织损伤程度，并进行肺损伤评分［9］。

1.4 肺组织TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表达水平检测 采用RT-PCR法。取液氮速冻的左肺上叶肺组织100 mg，制备匀浆。按TRIzol试剂一步法提取总RNA，M-MLV逆转录酶进行逆转录合成cDNA，用TaqDNA多聚酶进行PCR扩增，以β-actin作为内参照(引物序列略)。TLR4模板变性:95℃5 min预变性，扩增循环34周，94℃30 s变性，57℃40 s退火，72℃30 s延伸，扩增循环34周，最后72℃延伸7 min，预期产物大小419 bp;NF-κB模板变性: 95℃预变性5 min，扩增循环32周，94℃变性30 s，65℃退火40 s，72℃延伸30 s，扩增循环32周，最后72℃延伸7min，预期产物大小296 bp;β-actin模板变性温度:95℃预变性5 min，扩增循环32周，94℃变性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸30 s，扩增循环32周，最后72℃延伸7 min，预期产物大小240 bp。取PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用Bio-Rad图像分析系统测得目的基因与内参β-actin的灰度值。mRNA相对表达量=目的基因灰度值/ β-actin灰度值。

1.5 肺组织VEGF、ICAM-1及VCAM-1水平检测取冻存的右肺上叶肺组织匀浆，采用ELISA法分别检测肺组织中VEGF、ICAM-1及VCAM-1水平。操作严格按ELISA试剂盒说明书进行。

1.6 肺组织总Akt(t-Akt)、p-Akt含量检测 采用Western blotting法［10］。取冻存的左肺下叶肺组织提取总蛋白，20μg蛋白上样后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，将分离的总蛋白立即转印到PVDF膜上，并在封闭液(5%脱脂奶粉)中封闭1 h，分别加入一抗(兔抗鼠t-Akt和p-Akt多克隆抗体1∶1 500)4℃过夜，二抗(HRP标记的山羊抗兔抗体)37℃反应1 h，并以兔抗鼠β-actin(1∶500)单克隆抗体作为对照。Bio-Rad图像分析系统行蛋白条带灰度值测定，以t-Akt、p-Akt蛋白条带灰度值与β-actin蛋白条带灰度值之比分别作为t-Akt、p-Akt的相对表达量。

1.7 肺毛细血管通透性检测 取每组剩余10只大鼠，经尾静脉注射伊文思蓝20 mg/kg后0.5 h处死，留取动脉血并完整分离左侧肺组织。动脉血离心，取上清10μL加入990μL生理盐水。用紫外线分光光度计在620 nm波长处测定血清吸光度值;取分离的左肺组织，用生理盐水灌洗后收集支气管肺泡灌洗液，测定其在620 nm波长处的吸光度值。以上述两吸光度值比代表肺毛细血管通透性［11］。

1.8 统计学方法 采用SPSS16.0统计学软件包分析数据。正态分布的计量资料以±s表示，进行方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用重复测量数据的方差分析;模型组NF-κB mRNA与TLR4 mRNA、VEGF、ICAM-1及VCAM-1水平的相关性分析采用Spearman相关分析法。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织病理学改变及肺损伤评分光镜下，对照组大鼠肺组织结构正常，肺泡形态完整，肺间质结构清晰;模型组肺泡、肺间质充血、水肿明显，肺泡腔内有大量中性粒细胞浸润及少量红细胞渗出，可见不同程度的塌陷及肺不张;APN干预、治疗组肺间质充血、水肿程度较模型组减轻，肺泡腔内仅有少量中性粒细胞浸润。肺损伤评分模型组为(4.87±0.91)分、APN干预组为(2.33±0.47)分、APN治疗组为(3.26±0.64)分、对照组为(1.02± 0.19)分，前三组均显著高于对照组，其中APN干预组、治疗组均显著低于模型组，P均＜0.05。

2.2 各组大鼠肺组织TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表达 与对照组比较，余三组大鼠肺组织TLR4 mRNA、NF-κBmRNA表达均明显增加，其中APN干预组、治疗组均显著低于模型组。详见表1。

表1 四组大鼠肺组织TLR4 mRNA及NF-κB m RNA表达比较(±s)

表1 四组大鼠肺组织TLR4 mRNA及NF-κB m RNA表达比较(±s)

注:与对照组比较，*P＜0.05;与模型组比较，ΔP＜0.05

组别 TLR4 mRNA NF-κBmRNA模型组 0.87±0.13* 0.92±0.14* APN干预组 0.54±0.10*Δ 0.52±0.09*Δ APN治疗组 0.58±0.11*Δ 0.63±0.11*Δ对照组0.34±0.06 0.41±0.08

2.3 各组大鼠肺组织VEGF、ICAM-1及VCAM-1水平 与对照组比较，余三组大鼠肺组织VEGF、ICAM-1及VCAM-1水平均明显增加，其中APN干预组、治疗组均显著低于模型组。详见表2。

2.4 各组大鼠肺组织t-Akt、p-Akt含量 与对照组比较，余三组大鼠肺组织p-Akt含量均明显增加，其中APN干预组、治疗组均显著高于模型组。详见表3。

表2 各组大鼠肺组织VEGF、ICAM-1及VCAM-1水平比较(±s)

表2 各组大鼠肺组织VEGF、ICAM-1及VCAM-1水平比较(±s)

注:与对照组比较，*P＜0.05;与模型组比较，ΔP＜0.05

组别 VEGF(pg/mg) ICAM-1(ng/mL)VCAM-1(ng/mL)模型组 193.31±37.62* 232.41±40.08* 37.87±7.47* APN干预组 112.68±22.05*Δ 184.84±30.21*Δ 20.56±4.19*Δ APN治疗组 132.54±25.08*Δ 201.63±38.19*Δ 22.54±4.81*Δ对照组78.39±17.41 145.31±26.03 13.34±2.06

表3 各组大鼠肺组织t-Akt、p-Akt相对表达比较(±s)

表3 各组大鼠肺组织t-Akt、p-Akt相对表达比较(±s)

注:与对照组比较，*P＜0.05;与模型组比较，ΔP＜0.05

组别t-Akt p-Akt模型组 0.48±0.07 0.39±0.06* APN干预组 0.46±0.06 0.45±0.07*Δ APN治疗组 0.45±0.06 0.44±0.07*Δ对照组0.47±0.06 0.26±0.03

2.5 各组大鼠肺毛细血管通透性 肺毛细血管通透性模型组为1.82±0.33、APN干预组为0.89± 0.18、APN治疗组为1.26±0.23、对照组为0.28± 0.05，前三组均显著高于对照组，其中APN干预、治疗组均显著低于模型组，P均＜0.05。

2.6 指标间的相关性 脓毒症大鼠肺组织NF-κB mRNA表达与TLR4 mRNA、VEGF、ICAM-1及VCAM-1水平均呈显著正相关(r值分别为0.963、0.958、0.937、0.942，P均＜0.05)。

3 讨论

毛细血管通透性增加导致肺水肿是ALI的重要病理生理特征，且肺水肿的严重程度与ALI/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)预后呈正相关［12］。脓毒症所致ALI使肺微血管通透性增加，大量液体渗入肺组织间隙，加重组织细胞的缺氧;同时大量炎症细胞在肺组织中聚集，通过释放蛋白酶及氧自由基等直接损伤肺组织细胞［13］。本研究显示，模型组肺毛细血管通透性增加，大量体液及炎症细胞由肺血管溢出，导致肺间质水肿、肺泡充血。VEGF是已知体内活性最强的促进血管通透性的物质，肺脏为其最大供应脏器，主要由肺泡Ⅱ型上皮细胞表达。肺组织上皮屏障被破坏时，VEGF可引起血管通透性过度增加，最终导致肺水肿;脓毒症大鼠肺组织VEGF蛋白表达显著增高［14］。ICAM-1及VCAM-1同属于黏附分子免疫球蛋白超家族类。正常生理条件下，肺血管内皮细胞表达少量的ICAM-1，脓毒症时ICAM-1则过量表达;脓毒症大鼠肺血管内皮细胞的坏死和凋亡与ICAM-1的过度表达密切相关［15］。VCAM-1是中性粒细胞表面黏附分子—整合素配体，在中性粒细胞与内皮细胞黏附及迁移过程中发挥重要作用［15，16］。目前研究表明，脓毒症ALI的发生和发展与炎症反应过度密切相关，而TLR4-NF-κB信号传导通路是介导肺部炎症反应、导致组织损伤的关键环节［17］。在应激状态下，肺组织巨噬细胞、Kuffer细胞及脂肪细胞均表达TLR4。TLR4与脂多糖等配体结合后激活NF-κB，进而促进多种炎症介质释放; ICAM-1、VCAM-1、胶原酶等的合成及释放可介导炎症级联放大效应［18］。动物实验研究［19，20］显示，在脂多糖(LPS)诱导产生的脓毒症中，抑制NF-κB活性可降低ICAM-1等多种介质的表达，同时缓解多种组织毛细血管通透性增加的现象。本研究显示，与对照组比较，模型组大鼠肺组织损伤评分增加，TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表达升高，同时VEGF、ICAM-1及VCAM-1水平增加，且大鼠肺组织NF-κB mRNA表达与 TLR4 mRNA、VEGF、ICAM-1及VCAM-1水平均呈显著正相关。提示脓毒症ALI大鼠肺毛细血管通透性增加可能与TLR4-NF-κB信号传导通路介导的VEGF、ICAM-1及VCAM-1等表达上调有关。

APN是脂肪细胞分泌的具有多种生物学功能的活性多肽，除具有调节脂质代谢、改善胰岛素抵抗、保护心血管功能及抑制动脉粥样硬化等功能外，还是重要的免疫反应负性调节因子。我们的前期研究［8，21］发现，对脓毒症动物给予外源性APN可明显减轻炎症反应、减少肺组织炎性细胞浸润及炎性介质产生、减轻脓毒症导致的ALI及降低死亡率。Ouchi等［22］研究表明，APN可通过抑制NF-κB信号传导通路阻止单核巨噬细胞对血管内皮细胞的黏附，从而保护屏障功能的完整性、减轻血管内皮细胞炎症反应。本研究表明，与模型组比较，APN干预组和治疗组大鼠肺损伤明显减轻、肺毛细血管通透性降低，且肺组织TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、VEGF、ICAM-1及VCAM-1表达降低。表明APN可能通过TLR4-NF-κB信号传导通路下调相关黏附分子的表达，减轻肺部炎症反应，改善CLP所致肺毛细血管通透性增加。PI3K属于信号转导酶家族，主要参与细胞增殖与存活的调控。Akt是PI3K的下游产物。新近研究［25］显示，PI3K/Akt信号传导通路在炎症的发生、发展和内毒素血症的调控中发挥重要作用。抑制PI3K/Akt信号传导通路可增加细菌LPS介导的炎症因子及血浆中E-选择素等黏附分子的表达。Kim等［6］研究发现，PI3K激活剂(胰岛素)可降低VEGF介导产生的ICAM-1、VCAM-1及E-选择素表达;且PI3K/Akt信号传导通路抑制内皮细胞炎症反应的作用可能是通过抑制NF-κB活化实现的。而外源性APN可激活PI3K，减轻内皮细胞炎症反应［7］。本研究显示，与模型组比较，APN干预组和治疗组大鼠肺组织p-Akt含量明显增加。提示APN可能通过PI3K/Akt信号传导通路抑制NF-κB活化，减轻脓毒症ALI、改善肺毛细血管通透性，发挥肺保护作用。

综上所述，外源性APN可明显减轻脓毒症大鼠ALI、降低肺毛细血管通透性，机制可能为通过PI3K/Akt信号传导通路抑制NF-κB活化，降低黏附分子VEGF、ICAM-1及VCAM-1表达。

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