异硫氰酸苄酯对脑胶质瘤U-87 MG细胞周期的影响及其机制

李文明，吴 琦，朱 彧

(1北京红惠新医药科技有限公司，北京102600;2天津市环湖医院，天津市脑血管与神经变性重点实验室)

原发性脑胶质瘤为常见恶性肿瘤之一，多数患者在发现肿瘤时已经无法手术，化疗为重要辅助治疗手段［1］。异硫氰酸苄酯(BITC)是存在于花椰菜、卷心菜和水芹菜等十字花科植物中的抗肿瘤成分［2，3］，已被证实具有体外阻滞脑胶质瘤细胞周期的作用，但机制尚不明了。本研究观察了BITC对人脑胶质瘤细胞系U-87 MG细胞周期的影响，并对其机制进行了分析。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人脑胶质瘤细胞系U-87 MG购于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所;细胞培养基购自Gibco公司;BITC购自Sig-ma公司;RT-PCR试剂盒购自Promega公司;细胞周期检测试剂盒购自BD Biosciences公司;单克隆检测抗体购自Santa Cruz公司;转录因子转录活性报告基因检测试剂盒购自Promega公司;ECL免疫印迹底物试剂盒购自Millipore公司;流式细胞仪CaliburTM购自BD公司;酶标仪和PCR仪购自Thermo公司。

1.2 实验方法

1.2.1 U-87 MG细胞培养 取U-87 MG细胞置于10 cm培养皿中，加入培养基(90%)的最低必需培养液(EMEM)及10%胎牛血清(FBS)，于37℃、5%CO2和饱和湿度的培养箱中培养，0.25%胰酶-EDTA消化传代，至对数生长期后用于下述实验。

1.2.2 BITC处理及U-87 MG细胞周期分析 取对数生长期U-87 MG细胞接种于6孔板中，24 h后分别加入PBS或2、5μmol/L的BITC(我们前期研究证实此两种浓度BITC对U-87 MG细胞的增殖抑制率分别＜5%和＜15%)，继续培养24 h，胰酶消化收集细胞，冷乙醇4℃固定过夜，冷PBS洗涤3次，加入含有RnaseA的碘化丙啶(PI)染液避光孵育30 min，用流式细胞仪检测细胞周期分布。

1.2.3 U-87 MG细胞周期相关基因蛋白检测 采用Western blot法。取上述用于细胞周期分析的U-87 MG细胞，收集细胞并裂解提取蛋白。BCA法测定细胞裂解物的蛋白含量，取等量蛋白质以12% SDS-PAGE法分离并转移至PVDF膜上，以Cyclin B1(1∶400)、Cdc2(1∶400)、p21(1∶400)、Cdc25C (1∶400)和磷酸化Akt蛋白(p-Akt1∶300)单克隆抗体室温孵育4 h，检测目标蛋白。洗去一抗，以HRP连接的二抗室温孵育2 h，洗涤后以ECL试剂盒显示免疫反应条带。β-actin作为内参。

1.2.4 U-87 MG细胞周期相关基因mRNA检测采用RT-PCR法。取上述用于细胞周期分析的U-87 MG细胞，用Trizol法提取各组总RNA，用RT-PCR试剂盒进行逆转录得到cDNA。Cyclin B1上游引物序列:5＇-CTGCCTGGTGAAGAGGAAGC-3＇，下游引物序列:5＇-GAGTGCTAATCTTAGCATGC-3＇;Cdc2上游引物序列:5＇-CCTAGCATCCCATGTCAAAAACTTGG-3＇，下游引物序列:5＇-TGATTCAGTGCCATTTTGCCAGA-3＇，p21上游引物序列:5＇-CACTCCAAACGCCGGCTGATCTTC-3＇，下游引物序列:5＇-TGTAGAGCGGGCCTTTGAGGCCCTC-3＇;Cdc25C上游引物序列: 5＇-CAGGAAGTGCA1TFAGCTGGGATG-3＇，下游引物序列:5＇-ATCGACGGGGAGCGATATAGGC-3＇;β-actin上游引物序列:5＇-TGAGCGCGGCTACAGCTT-3＇，下游引物序列:5＇-TCCTTAATGTCACGCACGATTT-3＇。94℃变性3 min，按下述条件扩增35个循环:95℃5 s，65℃35 s，72℃60 s;最后72℃延伸5min。以β-actin作为内参照，2-ΔΔCt法分析基因相对表达量。1.2.5 NF-κB、缺氧诱导因子(HIF)和真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)转录活性检测 取对数生长期的U-87 MG细胞接种于6孔板中，继续培养24 h后分别转染NF-κB、HIF和eIF4E荧光报告质粒，继续培养6 h后更换新鲜培养基，试验孔中分别加入PBS或2、5μmol/L的BITC，继续培养24 h，根据试剂说明书方法检测NF-κB、HIF和eIF4E的转录活性。

1.3 统计学方法 应用SPSS13.0软件进行数据分析。计量资料以±s表示，用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行比较。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 U-87 MG细胞周期分布变化 经PBS和浓度为2、5μmol/L的BITC作用后，U-87 MG细胞G2/M期比例分别为11.7%、34.5%和48.3%，后两者均显著高于前者，P均＜0.05。详见图1。

图1 U-87 MG细胞周期分布

2.2 细胞周期相关基因的蛋白及mRNA表达变化与对照者比较，2、5μmol/L的BITC作用后U-87 MG细胞的Cyclin B1、Cdc2、Cdc25C、p-Akt蛋白水平均显著下降，而p21蛋白水平显著上升(P均＜0.05)，详见图2。2、5μmol/L的BITC作用后U-87 MG细胞周期相关基因mRNA表达亦有显著差异，与对照者的比例Cyclin B1 mRNA分别为37.5%和18.5%，Cdc2 mRNA分别为68.4%和 20.3%，Cdc25CmRNA表达分别为58.2%和22.9%，p21 mRNA分别为164.3%和224.5%，P均＜0.05。

2.3 U-87 MG细胞NF-κB、HIF和eIF4E的转录活性 2、5μmol/L的BITC作用后U-87 MG细胞转录因子的活性均显著下降，与对照者的比例NF-κB分别为 36.7%和 18.5%，HIF分别为 68.2%和33.8%，eIF4E分别为52.0%和 38.4%，P均 ＜0.05。

图2 细胞周期相关基因的蛋白表达

3 讨论

脑胶质瘤是最常见的恶性脑部原发性肿瘤。研究发现，经常食用十字花科植物可以降低癌症的患病率，而其主要成分之一BITC具有抑制脑胶质瘤的作用，但具体机制尚无深入研究。多项研究证实，细胞周期蛋白在细胞周期调节中起重要作用，其中Cyclin B1在细胞周期S期阶段开始表达，在G2/M阶段到达峰值，随后逐渐消失。Cyclin B1表达异常可导致细胞周期紊乱，并进而诱发恶性肿瘤。Cyclin B1和Cdc2组成的复合体在G2/M期中发挥重要作用，Cdc25C可使Cdc2去磷酸化，而活化的Cdc2则可推动细胞进行有丝分裂。大量研究表明，多种恶性肿瘤中存在上述三种基因的异常表达。p21是一种重要的细胞周期调控蛋白，是p53的下游基因，可通过阻断增殖细胞核抗原活化DNA聚合酶的活性抑制DNA合成，阻滞细胞周期、抑制细胞分裂，被认为是一种抑癌基因［4～10］。

本研究显示，2、5μmol/L的BITC作用后U-87 MG细胞周期G2/M期比例显著升高，Cyclin B1、Cdc2、Cdc25C蛋白和mRNA表达均显著下调，p-Akt蛋白表达显著降低，p21蛋白表达显著上调。提示低浓度的BITC可将U-87 MG细胞周期阻滞在G2/ M期，机制可能为调节细胞周期相关基因表达。本研究还发现，2、5μmol/L的BITC作用后U-87 MG细胞的转录因子NF-κB、HIF和eIF4E的转录活性均显著下降。提示BITC可抑制U-87 MG细胞Akt/ NF-κB信号通路及其下游靶点HIF和eIF4E的转录活性，进而调节下游基因 Cyclin B1、Cdc2、p21和Cdc25C等的表达，最终抑制肿瘤细胞的生长和恶化。

综上所述，BITC对U-87 MG细胞周期有阻滞作用，机制可能与抑制Akt/NF-κB信号转导路径，进而调节细胞周期相关基因表达有关;此为胶质瘤的细胞周期靶点治疗提供了新思路。

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