黄芩多糖的超声提取工艺优化及抗氧化活性研究

李海平，陈瑞战，金辰光，蔡 艳，陆 娟，刘春明，苏丽红

（长春师范大学化学学院，吉林长春130032）

黄芩为唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干根，别名为山茶根、土金茶根，含有黄酮类[1]、苷类[2]、多糖类[3]、萜类[4]、挥发油[5]等活性成分，具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗辐射、抗炎、解热等多种药理活性[6]。

多糖是由10个分子以上单糖通过糖苷键结合而成的高分子碳水化合物，广泛存在于植物、菌类等有机体中，不仅是组织细胞的结构材料，而且参与生命体中各种细胞的活动，能够控制细胞的分裂、分化，调节细胞的生长和衰老，具有抗肿瘤[7]、免疫调节[8]、抗氧化[9]等广泛的药理活性。多糖的常规提取方法是热回流提取、热水浸泡提取或稀酸（碱）浸泡提取，常规提取需要较长的时间、较高的能耗、较低的提取效率，且容易引起多糖的结构变化和活性的降低[10]。超声提取是当一定频率的大量超声波作用于提取液时，溶液中尺寸适宜的小泡产生共振，小泡随声波的变化而迅速胀大和压缩，从而产生高压冲击波，这种强烈的冲击作用能使固体原料破碎，也能造成生物细胞壁及整个生物体破裂，加速细胞内物质的释放、溶解和扩散，从而可大幅提高有效成分的提取率、缩短提取时间，降低能量消耗[11]。

本文以黄芩根为原料，采用超声提取其中的多糖；在单因素实验的基础上，运用响应面设计构建定量描述多糖提取得率与各工艺参数的数学模型，进而优化得出最佳提取工艺条件，并评价粗多糖总抗氧化能力和对各种自由基的清除能力，为黄芩多糖的综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄芩根 产自黑龙江，购于长春中药材药店；2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl（DPPH）、2，4，6-tripyridyl-s-trazine（TPTZ） 购于Sigma公司（St.Louis，MO，America）；番红、邻苯三酚 国药集团化学试剂有限公司；硫酸亚铁、30%过氧化氢 北京化工厂；抗坏血酸（VC） 上海试剂二厂；乙二胺四乙酸二钠盐、三氯化铁、无水乙醇、浓硫酸、苯酚、葡萄糖等 均为国产分析纯。

SL-2010N型多频超声波细胞粉碎仪 南京顺流仪器有限公司；UV-2401型紫外-可见分光光度计日本岛津公司；FA1604A型电子天平 Sartorius；RV10型旋转蒸发仪 德国IKA公司；DZ-2BCII型真空干燥箱 天津泰斯特；FD-1-50型冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；GSY-11型恒温水浴箱 北京市医疗设备厂；SHB-B88型循环水式多用真空泵 菏泽市生化仪器厂；TDL-40B型离心机 上海安亭科学仪器厂；LK-200A型高速中药粉碎机 浙江温岭市创力药材器材制造；Tecan型酶标仪 奥地利GENios ELIASA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理 黄芩根切片，60℃下真空干燥24h，用高速中药粉碎机粉碎成粉末，于500m L圆底烧瓶中加入石油醚回流脱脂、脱色两次，每次2h，抽滤，滤渣挥干溶剂备用。

1.2.2 粗多糖超声提取 准确称取黄芩预处理样品5g于提取瓶中，加入蒸馏水150m L，浸泡6h，用多频超声波细胞粉碎仪，在一定温度（40～80℃）、超声功率（600～1200W）条件下，提取一定时间（10～50min），减压过滤，滤液减压浓缩至一定体积，加95%乙醇至最终乙醇浓度为70%，在4℃温度下沉化24h，减压过滤，沉淀用适量蒸馏水溶解，用Sevag法除去游离蛋白质，装于截留分子量3500u透析袋，用蒸馏水透析48h，除去单糖、无机盐等小分子成分，冻干得黄芩粗多糖，采用苯酚-硫酸法测量多糖含量[12]，计算提取得率：提取率（%）=（黄芩多糖质量/黄芩原料质量）×100。

1.2.3 多糖含量的测定 以葡萄糖为标准品，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。精密称取葡萄糖标准品1g，溶解后定容成50m L，然后稀释成0.25mg/m L标准液。准确量取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8m L葡萄糖标准液于试管中，加蒸馏水至2.0m L，然后分别加入1.0m L 5%苯酚溶液，振荡，迅速加入5m L浓H2SO4，置于沸水浴中恒温20m in，取出冷却至室温，于490nm波长下，以试剂空白（2m L蒸馏水代替葡萄糖）为参比，测定吸光值。

1.2.4 单因素实验 以黄芩粗多糖提取得率为指标，分别考察超声时间（10、20、30、40、50m in）、提取温度（40、50、60、70、80℃）和超声功率（600、750、900、1050、1200W）对黄芩粗多糖提取得率的影响。

1.2.5 响应面法优化提取工艺 在单因素实验基础上，采用Box-Benhnken Design实验设计方案，以超声时间（X1）、提取温度（X2）和超声功率（X3）为考察变量，以黄芩粗多糖提取得率（Y）为响应值，应用Design-Expert 6.0软件，建立数学回归模型，确定黄芩粗多糖的最佳超声提取工艺参数。实验因素和水平设计见表1。

表1 实验因素水平及编码Table1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.6 总抗氧化活性测定 分别配制pH 3.6的300mmol/L醋酸钠缓冲液，10mmol/L TPTZ溶液（溶解在40mmol/L盐酸中）和20mmol/L FeCl3溶液，并以10∶1∶1（v∶v∶v）的比例混合配制成FRAP试剂（现用现配）；取5μL不同浓度样品（1、2、3、4、5mg/m L）或标准品溶液加入96孔板中，迅速加入FRAP试剂150μL。在592nm波长下测定0m in和4m in时样品和标准品的吸光度值，每个样品平行测定三次，以500μmol/L VC溶液作为标准品，计算样品的FRAP值，实验结果按此计算：FRAP值（μmol/L）=（0-4minΔA592样品）/（0-4min ΔA592标准品）×500

1.2.7 对羟基自由基的清除作用 利用Fenton反应检测各种自由基清除剂对羟基自由基（·OH）的清除作用。·OH由EDTANa2-Fe（II）-H2O2体系产生，由于·OH可特异地使番红褪色，根据褪色程度用比色法来衡量·OH的含量。反应体系中加入1.0m L pH为7.4的磷酸缓冲液，0.2m L番红（520μg/m L），1.0m L EDTANa2-Fe（II），再加入1.0m L不同浓度的样品溶液，最后加入0.8m L 6%的H2O2，于40℃水浴保温30m in，在波长514.9nm处测定吸光值（A样品）。每个样品浓度作三个平行样，取其平均值。空白组以等体积的重蒸水代替样品溶液（A空白）；对照组以等体积的重蒸水代替样品溶液和EDTANa2-Fe（II）溶液（A对照）。实验结果以清除率表示：清除率（%）=（A样品-A空白）/（A对照-A空白）×100。

1.2.8 对DPPH自由基的清除作用 取不同浓度的样品溶液40μL于96孔板中，分别加入200μL（6.5×10-5mol/L）DPPH甲醇溶液，避光反应30min，于515nm波长下测定吸光值Ai。对DPPH·的清除率可表示为：清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100，其中：Ai为DPPH·与样品反应后的吸光度，Aj为空白样品（40μL样品+200μL甲醇）的吸光度，Ac为未加样的DPPH·（40μL水+200μL DPPH·）的吸光度，每一待测样品平行测定三次，取其平均值。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 超声时间对多糖提取率的影响 固定料液比1∶30（g/m L）、提取温度60℃、超声功率600W，考察超声时间10、20、30、40、50min对黄芩粗多糖提取率的影响，结果如图1所示。由图1可知，提取时间在30m in内，黄芩多糖提取得率随超声时间的延长逐渐增大，这说明在该段时间范围内，增加超声时间，超声波对黄芩细胞组织的影响程度增加，多糖的溶解更加完全，同时利于多糖由固体组织内部充分扩散到周围提取溶剂中；但超声时间超过30m in后，多糖提取率随超声时间的增加而缓慢降低，这可能是由于在较强的超声波作用下，超过一定超声时间导致多糖部分降解，致使多糖提取得率降低。因此，超声时间选择30m in较为适宜。

图1 超声时间对提取率的影响Fig.1 Effectof ultrasonic time on the extraction yield

图2 提取温度对提取率的影响Fig.2 Effectof extraction temperature on the extraction yield

2.1.2 提取温度对多糖提取率的影响 固定料液比1∶30（g/m L）、超声时间30m in、超声功率600W，考察提取温度40、50、60、70、80℃对黄芩多糖提取率的影响，结果如图2所示。由图2可知，在40～60℃温度范围内，多糖提取得率随提取温度的增加而快速增加，在这一温度范围内，温度升高多糖溶解度增大，多糖由固体组织内部向周围提取溶剂的扩散速率增大，因此多糖提取率快速提高，在60℃时多糖提取得率达到峰值；但超过60℃后多糖提取得率快速下降，这主要是由于在超声提取的过程中会释放大量的能量，提取温度过高可能会造成大分子多糖糖苷键断裂，导致多糖的结构变化、提取得率降低，这一现象在其他多糖的超声提取过程也已发现[13]。因此，采用超声波辅助提取黄芩多糖时，应选用60℃左右的温度比较适宜。

2.1.3 超声功率对多糖提取率的影响 固定料液比1∶30（g/m L）、提取温度60℃、超声时间30m in，考察超声功率600、750、900、1050、1200W对黄芩粗多糖提取得率的影响，结果如图3所示。由图3可以看到，超声功率在600～750W范围内，多糖提取率随超声功率的增加而快速增加。但功率超过750W时，多糖提取得率随功率增加快速降低，说明较高的超声功率会产生较强的空化和剪切效应，这些强烈的作用不仅能破坏细胞壁，也可能导致多糖的快速降解，当降解的速率超过多糖增加的速率，会造成多糖提取率的下降。而且对于特定的物质来说，超声波作用效果与超声功率、提取物的结构与性质有关系。不同的提取物需要不同的超声功率。所以，黄芩多糖的超声提取选用750W超声功率较为适宜。

图3 超声功率对提取得率的影响Fig.3 Effectof ultrasonic power on the extraction yield

2.2 响应面设计实验结果

表2 Box-Behnken实验设计方案及结果Table2 Box-Behnken designmatrix and response values

2.2.1 Box-Behnken设计方案 根据单因素实验结果，选择超声时间（X1）、提取温度（X2）以及超声功率（X3）3个因素，以黄芩粗多糖提取率（Y）为响应值进行优化，根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理[14]，设计3因素3水平的实验方案，实验结果见表2。

2.2.2 回归方程的构建和方差分析 通过SAS数据分析软件对表2中的响应面实验结果进行回归分析，以黄芩粗多糖的提取得率（Y）为因变量，超声时间（X1）、提取温度（X2）以及超声功率（X3）为自变量，进行回归拟合，得到回归方程：

对上述回归模型进行F检验，判定回归方程中各变量对响应值影响的显著性，概率越小，则相应变量的显著程度越高，方差分析结果见表3。

表3 响应面回归模型的方差分析结果Table3 ANOVA for response surface quadraticmodel

由方差分析表3可以看出，各因素对提取率影响次序为：超声功率＞提取温度＞超声时间。模型F= 30.6139，p＜0.0001差异有统计学意义，说明建立的模型极显著（p＜0.01）；失拟项F=0.826，失拟项相对于绝对误差不显著，说明模型的拟合程度良好，未知因素对实验结果干扰很小。模型R2=0.975，Ad j R2=0.943，表明模型与实际实验拟合较好，实验误差较小，可以用此模型对黄芩多糖的超声提取进行分析和预测。

2.2.3 响应面分析 超声提取过程中，各因素对黄芩多糖提取率影响的三维响应曲面见图4～图6。响应面图形是响应值Y对应于实验因素X1、X2、X3所构成的三维空间的曲面图，响应面图可以直观的反映各因素及它们之间的交互作用对响应值的影响。

固定超声功率750W，超声时间和提取温度对提取率的交互影响如图4所示，在20～31m in超声时间内，随超声时间的增加，多糖提取率逐渐增加，在该段时间范围内延长超声时间有利于多糖的提取，当超声时间超过31m in后出现提取得率缓慢降低的趋势，发生这一现象的可能原因是长的超声时间导致了多糖的降解[15]；而在50～63.8℃提取温度范围内，提取率随温度的增加快速增加，当提取温度超过63.8℃时，随提取温度的增加提取率快速降低，发生这一现象的原因除了在较高的温度和较强的超声波作用多糖可能降解之外，另一方面随温度的升高超声波的空化效应降低，从而导致提取率的降低[16]。综合看出提取温度对提取率的影响相对较大。

图4 超声时间和提取温度对提取得率影响的响应面图Fig.4 Response surface plots showing the effectof ultrasonic time and extraction temperature on extraction yield

固定提取温度60℃，超声时间和超声功率对提取率的交互影响如图5所示。由图5可以看到，超声时间和超声功率的等值线图呈现显著的椭圆形，说明二者的交互作用较强。在20～27.5m in的超声时间和600～675W的超声功率范围内，提取率随时间和功率的增加由10.2%逐渐增加到11.1%；之后随提取时间和超声功率的增加，提取率逐渐降低。说明在较强的超声功率作用下，在短时间内多糖的溶解和扩散即可达到平衡，而过高的超声功率和长的超声时间共同的作用结果会成提取率的降低。

图5 超声时间和超声功率对提取得率影响的响应面图Fig.5 Response surface plots showing the effectof ultrasonic time and ultrasonic power on extraction yield

固定超声时间30m in，提取温度和超声功率对提取率的交互影响如图6所示。由图6可以看到，多糖提取率随超声功率和提取温度的增加逐渐增加，在超声功率为787W、提取温度为61.5℃时多糖提取得率达到最大值11.1%，之后随超声功率和提取温度的增加逐渐降低，说明在一定的范围内增加超声功率和提取温度都有利于多糖提取率的增加，但过分增加超声功率和提取温度也都会造成提取率的降低，适宜的超声功率和提取温度对黄芩多糖的提取是十分必要的。

图6 提取温度和超声功率对提取得率影响的响应面图Fig.6 Response surface plots showing the effectof extraction temperature and ultrasonic power on extraction yield

2.2.4 最优提取工艺的确定 通过对响应面图以及利用Design-Expert 6.0的软件对实验数据的优化分析，确定了超声提取黄芩多糖的最佳提取条件：超声时间30.05m in，提取温度60.12℃，超声功率754.8W，该条件下黄芩多糖理论提取率为12.16%。考虑到实验的可操作性，把上述优化提取条件修正为超声波提取时间为30min，超声波提取温度为61℃，超声波功率为755W，重复3次进行验证实验，得到黄芩多糖平均提取率为12.95%，相对预测值的误差为0.65%，相对误差不到1%，验证了模型的可行性。因此应用响应面法优化超声提取黄芩多糖获得的工艺参数是可靠的，具有一定的实用价值。

2.3 抗氧化活性

2.3.1 黄芩粗多糖的总抗氧化活性 FRAP法反映的是样品总的还原能力，一些学者因此认为该法测定结果可用来反映样品总抗氧化活性[17]。以VC溶液作为标准品，不同浓度的粗多糖的总抗氧化活性如图7所示。从图7可以看出，在实验的浓度范围内，黄芩粗多糖具有较高的抗氧化活性，且抗氧化性与浓度成正相关关系。其抗氧化活性可能与多糖中单糖的组成、糖醛酸和蛋白质含量、分子量分布范围以及提取方法等多种因素有关[18]，但其作用机制有待于进一步研究。

图7 黄芩多糖总抗氧化活性Fig.3 Antioxidant power（FRAP）of the crude polysaccharides from Scutellaria（n=3）

2.3.2 黄芩多糖对·OH的清除活性 ·OH是已知活性最强的活性氧自由基，可夺取蛋白质、核酸等生物大分子的氧原子，引起机体氧化损伤，使机体抵抗力降低，导致癌变、过度衰老等多种疾病的发生，清除·OH的能力是评价抗氧化物质的重要指标[19]。由图8可以看出，不同浓度黄芩多糖有较高的·OH清除活性，清除活性随多糖浓度的逐渐增加，在1～3mg/m L的低浓度范围内，清除活性远低于VC，而在3～5mg/m L较高的浓度范围内对·OH的清除活性逐渐接近VC，说明该多糖有较高的·OH清除活性。

图8 黄芩多糖·OH清除活性Fig.8 Scavenging activity to·OH of the crude polysaccharides from Scutellaria（n=3）

2.3.3 黄芩粗多糖对DPPH·的清除活性 DPPH·是一种以氮为中心，具有单电子的稳定自由基，被广泛地用于测定生物试样以及食品等的抗氧化能力。DPPH·有的孤电子在517nm处有强的特征吸收，其醇溶液呈紫色，抗氧化剂可直接与孤对电子配对，使DPPH·吸收减弱，颜色从紫色逐渐减退，褪色程度与其接受的电子数量成量效关系，因此可以用分光光度法进行测定，定量反应其抗氧化能力[20]。不同浓度黄芩多糖对DPPH·的清除作用结果见图9。由图9可知，黄芩多糖具有一定的DPPH·清除能力，清除率与多糖浓度呈现正相关关系。特别是在浓度为5mg/m L时，黄芩多糖对DPPH·的清除率可达到94.22%，接近于该浓度下VC对DPPH·的清除率（98.34%）。这说明黄芩多糖具有较高的抗氧化活性，可以探索作为天然的抗氧化剂应用于功能食品和药品。

图9 黄芩多糖DPPH·清除活性Fig.9 Scavenging activity to DPPH·of the crude polysaccharides from Scutellaria（n=3）

3 结论

在单因素实验的基础上，通过Box-Behnken实验设计建立了超声提取黄芩多糖的回归模型，经过方差分析建立的模型与实际实验拟合较好，实验误差较小，可以用于提取率的预测分析；通过响应面分析优化出了最佳提取条件：超声时间30min，提取温度为61℃，超声波功率为755W，按此工艺条件，黄芩多糖实验提取得率为12.95%，接近于模型的预测得率12.16%，说明优化得到的条件可靠。在测量的浓度范围内，黄芩多糖有较高抗氧化活性，抗氧化活性与浓度有很好的量效关系，可作为潜在天然抗氧化剂应用于功能食品和药品。

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