超声微波协同提取甘薯叶中黄酮类化合物的研究

2014-02-22刘汉文陈洪兴龚晓钰

食品工业科技 2014年16期

刘汉文，陈洪兴，龚晓钰

（盐城工学院化学与生物工程学院，江苏盐城224051）

甘薯属于旋花科甘薯属甘薯种草本植物，我国常年种植面积在6.7×106hm2以上[1]，是广泛栽培的四大作物之一。一直以来，人们利用的只是甘薯的块根，对于甘薯叶，除作饲料或部分食用外，大多数被抛弃于田埂，造成了资源的极大浪费。甘薯叶的营养价值比甘薯高，其蛋白质和脂肪含量尤其是无机盐含量很高，胡萝卜素、VB1、VB2、VC比其他常见蔬菜含量高。甘薯叶抗癌、抗氧化作用比常见蔬菜强。向仁德等[2]从引种的巴西甘薯叶的乙醇提取物中，柱层析得到8个化合物，其中5个已经确认为黄酮类化合物，分别为檞皮苷、山奈素-4’，7-二甲醚、商陆黄素、檞皮素、檞皮素-3’，4’，7’-三甲醚。谭桂山等[3]也从引种的巴西甘薯叶中分离出檞皮素。邹耀洪[4]从国产甘薯叶中分离出4种黄酮类化合物，并鉴定其为檞皮素、檞皮素-3-O-β-D-葡萄糖-（1，6）-a-L-鼠李糖苷、4’，7-二甲氧基山奈酚、檞皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷。目前，从甘薯叶中提取黄酮类化合物的方法主要有有机溶剂提取法、超声波提取法、微波法提取等。朱红等[5]以50%乙醇作为提取剂，料液比1∶30，温度为70℃，回流提取2h，得到甘薯叶中黄酮类化合物的提取率为5.87%；王玫等[6]利用超声波法提取甘薯叶黄酮，得到甘薯叶黄酮提取率为8.22%。本实验报道用超声振动与微波两种作用方式相结合辅助溶剂提取甘薯黄酮类化合物，利用超声波振动的空化作用以及微波的高能作用，实现低温常压的条件下，黄酮类化合物的溶剂提取，避免破坏所提取的有机物分子的结构，并采用聚酰胺柱层析法分离了黄酮类化合物中的檞皮素。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甘薯叶苏薯8号；芦丁标准品纯度≥98%、槲皮素标准品纯度≥98% 国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、石油醚、乙酸乙酯、聚酰胺、氯仿、甲醇、硅胶、羧甲基纤维素钠均为AR。

XA-1粉碎机江苏金坛亿通电子有限公司；AY-220电子分析天平日本Shimadzu公司；CS101-2E电热恒温干燥箱上海时达实验仪器有限公司；SHZ-IIIB循环水真空泵上海仪表（集团）销售公司；UV-9100紫外可见分光光度计北京瑞利分析仪器公司；RE52CS旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂；XO-SM 50超声微波组合反应系统南京先欧生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 芦丁标准曲线的绘制准确称取经105℃干燥至恒重的芦丁标准品15.0mg，加甲醇溶解并定容至100m L，配成150μg/m L的芦丁标准溶液。准确吸取芦丁标准溶液0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00m L，相当于芦丁0、75、150、300、450、600μg移入25m L试管中，加入30%乙醇液至5m L，各加5%亚硝酸钠溶液0.3m L，振摇后放置5m in，加入10%亚硝酸铝溶液0.3m L摇匀后放置6m in，加入1.0mol/L氢氧化钠溶液2m L，用30%乙醇定容至10m L，以以第一管为空白调零，摇匀后用1cm的比色杯，在510nm处测定吸光度[7]。以芦丁质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.2 甘薯叶黄酮类化合物的提取工艺流程甘薯叶→清洗→风干→粉碎→过筛（60目）→烘干至恒重→乙醇溶剂预浸→超声微波协同提取→抽滤→浓缩→测吸光度→计算提取率。

准确称取1g烘干至恒重的甘薯叶粉末，加入一定量一定浓度的乙醇，预浸提1h，进行超声-微波协同萃取。将抽滤得到的滤液转入100m L容量瓶中，加水定容到100m L。精确吸取2m L定容后的溶液加入30%乙醇液至5m L，加入5%亚硝酸钠溶液0.3m L，振摇后放置5m in，再加入10%亚硝酸铝溶液0.3m L摇匀后放置6min，加入1.0mol/L氢氧化钠溶液2m L，最后用30%乙醇定容至10m L，测定其吸光度。

式中：x—以芦丁为参照计算甘薯叶中黄酮类化合物的提取率；y—提取溶液的吸光度。

1.2.2.1 乙醇体积分数对提取率的影响在料液比1∶50、超声功率300W、超声时间3m in、微波功率100W、微波时间3min条件下，分别考察50%、60%、70%、80%、90%乙醇体积分数对甘薯叶黄酮化合物提取率的影响。

1.2.2.2 料液比对提取率的影响在乙醇体积分数80%、超声功率300W、超声时间3min、微波功率100W、微波时间3m in条件下，分别考察料液比1∶30、1∶40、1∶50、 1∶60、1∶70对甘薯叶黄酮化合物提取率的影响。

1.2.2.3 超声功率对提取率的影响在乙醇体积分数80%、料液比1∶50、微波功率100W、微波时间3min、超声时间3m in条件下，分别考察超声功率100、200、300、400、500W对甘薯叶黄酮化合物提取率的影响。

1.2.2.4 超声时间对提取率的影响在乙醇体积分数80%、料液比1∶50、超声功率300W、微波功率100W、微波时间3m in条件下，分别考察超声时间3、6、9、12、15m in对甘薯叶黄酮化合物提取率的影响。

1.2.2.5 微波功率对提取率的影响在乙醇体积分数80%、料液比1∶50、超声功率300W、超声时间3m in、微波时间3min条件下，分别考察微波功率50、100、150、200、250W对甘薯叶黄酮化合物提取率的影响。

1.2.2.6 正交实验设计根据上述实验，微波功率对甘薯叶黄酮提取率的影响图线趋势平缓，说明微波功率的变化对甘薯叶黄酮提取率的影响较小，保持微波功率150W，微波时间长，微波的高能作用会使甘薯叶中的活性成分破坏，选择微波作用时间3m in，以料液比、乙醇体积分数、超声功率、超声时间这4个因素进行正交实验，因素水平表见表1。

表1 正交实验因素水平表Table1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.3 聚酰胺柱层析柱分离甘薯叶黄酮类化合物

聚酰胺→浸泡→装柱→加样→乙醇梯度洗脱→收集→干燥称重。

准确称取2.00g上述最佳提取条件提取的黄酮类化合物，用石油醚、乙酸乙酯萃取，去除杂质，用少量乙醇溶解，将样品液沿管壁慢慢加入至柱顶部，并用少量乙醇把容器和滴管冲洗干净并全部加入柱内，慢慢打开活塞，调整液面和柱面相平为止，关闭活塞，然后，依次用100m L的蒸馏水、30%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、无水乙醇进行梯度洗脱。洗脱速度2m L/m in，洗脱下来的物质的质量采用多份收集，旋转蒸发器浓缩，每份定性检测，合并相同组分蒸干。

1.2.4 薄层色谱将5g硅胶G在搅拌下慢慢加入12m L 0.4%羧甲基纤维素钠水溶液中，慢慢调成糊状，倒在洁净的玻璃片上，用自制涂铺器进行涂铺，自然干燥。在105～110℃活化30～60min。用铅笔在距层析板底端0.5cm处画一条直线，然后用毛细管吸取上述洗脱液在直线上进行点样，样点直径不超过2mm，选择氯仿∶甲醇按15∶1，溶剂体积为8m L，上行展开，待展开剂上升至前沿约1cm处取出，迅速在展开剂最前沿处画一横线。用吹风机吹干，放入碘缸中显色。

1.2.5 数据处理每个实验重复3次，结果以SD±s表示。采用SPSS统计软件进行方差分析和F检验。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

以芦丁为标准品制作标准曲线来测定总黄酮化合物的含量。芦丁质量浓度与其吸光度的关系曲线的回归方程为：y=11.491x+0.0287（R2=0.9913）。式中，y表示吸光度，x表示芦丁的质量浓度。

2.2 乙醇体积分数对提取率的影响

图1 乙醇浓度对提取效果的影响Fig.1 The influence of ethyl alcohol concentration on the withdrawing effect

从图1可以看出，随着乙醇浓度的增加，溶液的吸光度增加，当浓度达到80%时，溶液的吸光度最大，提取效果最好；继续增加乙醇浓度，提取效果反而降低。原因可能是随着乙醇浓度升高，溶液极性增强，一些醇溶性杂质溶出量增加，这些成分与黄酮类物质竞争同乙醇-水分子结合[8]，导致黄酮的溶解度下降，从而黄酮化合物的提取率下降。

2.3 料液比对甘薯叶黄酮提取率的影响

图2 料液比对提取效果的影响Fig.2 The influence of proportion ofmaterial to liqiud on the withdrawing effect

由图2可以看出，随着溶剂量的增加，甘薯叶黄酮的浸提量增多，料液比1∶50时吸光度达到最高；随后再增加溶剂量提取效果反呈下降趋势。原因可能是样品量一定时，增加溶剂的量可以降低样品颗粒周围有效成分的浓度，有利于黄酮由原料向浸提液扩散，增大黄酮浸出率，有利于有效成分的溶出[9]，当溶剂用量增加到一定程度时，原料表面与浸提液之间的浓度差不再是影响黄酮提取效果的主要因素。

2.4 超声功率对甘薯叶黄酮提取率的影响

图3 超声功率对提取效果的影响Fig.3 The influence of ultrasonic power on the withdrawing effect

从图3可以看出，随着超声功率的增加，黄酮的提取效果也随着增加，当超声功率达到400W时提取率达到最高，继续增加超声功率吸光度有降低趋势。可能的原因是超声波机械破碎过程是一个物理过程，被浸提的生物活性物质在短时间内性质保持不变，生物活性不减，功率增大提高了破碎速度，缩短了破碎时间，极大地提高提取效果，但当功率过大时，黄酮类物质可能被破坏，使提取率降低。

2.5 超声时间对甘薯叶黄酮提取率的影响

图4 超声时间对提取效果的影响Fig.4 The influence of ultrasonic time on the withdrawing effect

从图4可以看出随着超声时间的增加，黄酮提取率不断增大，至6m in时，黄酮提取率达到最大。6m in之后，黄酮提取率逐渐下降。这一现象的原因可能是因为超声波会导致细胞内产生剧烈的涡流扩散，增大细胞内外有效成分的浓度差，从而加快溶质的传质速率，但随着超声波处理时间的延长，黄酮提取率反而下降，可能是其他成分溢出，与黄酮在乙醇溶液中形成竞争，降低了由颗粒内部向周围溶液的扩散程度[9]。

2.6 微波功率对甘薯叶黄酮提取率的影响

从图5可以看出，溶液的吸光度随着微波功率的提高而增加，微波功率在150W时提取率达到最高，当微波功率继续提高时，提取效果反而有下降的趋势。这可能是由于花生壳细胞中的极性分子和溶剂分子在微波作用下发生高速转动，随着功率增加而逐渐增强，促使细胞快速升温、升压，迫使细胞壁破裂，使细胞内组分迅速释放，从而有利于黄酮的提取[10]。但是，当微波功率过大时，其强热效应可能对有效成分产生破坏作用，导致黄酮含量下降[11]。

图5 微波功率对提取效果的影响Fig.5 The influence ofmicrowave power on the withdrawing effect

2.7 工艺条件的优化与结果分析

表2 L9（34）正交实验结果Table2 Test results of L34）orthogonal experiment

实验号 A B C D 提取率（%）1 1 1 1 1 5.71 2 1 2 2 2 6.45 3 1 3 3 3 5.12 4 2 1 2 3 5.19 5 2 2 3 1 7.03 6 2 3 1 2 5.66 7 3 1 3 2 5.75 8 3 2 1 3 6.65 9 3 3 2 1 5.62 k1 5.76 5.55 6.01 6.12-k2 5.96 6.71 5.75 5.95-k3 6.01 5.47 5.97 5.65-R 0.25 1.26 0.26 0.47-因素主→次 BDCA优水平 A3 B2 C1 D1优组合 B2D1C1A3

表3 方差分析结果Table3 The results of variance analysis

由表2正交实验极差分析可以看出，影响甘薯叶黄酮化合物提取的因素主次为：乙醇浓度＞超声时间＞超声功率＞料液比，最优组合B2D1C1A3。由表3方差分析结果可知：只有B（乙醇浓度）F值大于F0.05临界值，乙醇浓度对甘薯叶黄酮提取率具有显著影响，A因素SS值相对较小，可作为误差项。由于没有交互作用，故为加性模型，因而，可直观判断有B2D1C1参加的处理表现一定好于其他处理。

由于正交实验中无此组合，在乙醇浓度80%、料液比1∶60、超声功率300W、超声时间3m in、微波功率150W、微波时间3m in条件下，做3次验证实验，甘薯叶中黄酮类化合物的提取率为8.61%。表明实验所确定的工艺条件为最优条件。

2.8 甘薯叶黄酮化合物的分离

表4 不同浓度乙醇的洗脱效果Table4 The eluting effectof different concentrations of ethanol

洗脱下来的溶剂用旋转蒸发器浓缩点样见图6。

图6 薄层色谱Fig.6 Thin layer chromatography

由图6可见，糖、氨基酸、非酚类苷、鞣质等一部分物质主要集中在水及30%、50%、60%的乙醇洗脱液中，槲皮素主要集中在70%乙醇洗脱液和95%乙醇洗脱液中，无水乙醇中几乎没有槲皮素。因此，如忽略70%乙醇洗脱液和95%乙醇洗脱液中仍存在部分与碘结合的双键物质，通过表4可估算出样品中槲皮素的含量约为（24.6+7.7）/2000=1.62%。与李志[12]槲皮素含量占甘薯叶的总黄酮含量的1.3%～1.8%相一致。