超声波皂化法提取叶黄素的工艺研究

李曼　王宪青　梁英

摘 要：试验采用了超声波辅助KOH-碱溶液进行皂化工艺研究，以皂化碱液浓度、碱液加入量、皂化时间、皂化温度为自变量。通过响应面分析法，研究了各因素及其交互作用对万寿菊中叶黄素皂化反应的影响。结果表明：叶黄素皂化的最佳工艺条件为：KOH-碱溶液浓度11.35%、碱液加入量172.37mL、皂化温度51.55℃、皂化时间2.09h。叶黄素含量的预测值为15.53mg/g。当选取KOH-碱溶液浓度11%、碱液加入量170mL、皂化温度50℃、皂化时间2h的实际条件时，叶黄素的含量实际值达到15.64mg/g。

关键词：叶黄素；超声波皂化；响应面

万寿菊原产墨西哥[1]，是一种一年生草本植物，我国各地均有栽培，其花和叶可入药，有平肝清热、化痰、补血通经、去瘀生新、抗肿瘤、增强免疫力等功效[2]。它含有丰富的叶黄素，是一类含氧类胡萝卜素，分子式：C40H56O2，分子量为568.85[4]，在体内不能转换为VA，没有VA活性[5]。分子结构的碳骨架由中央多聚稀链和位于两侧的六元碳环组成，它主要有胡萝卜素类和叶黄素类两类，前者是不含氧的类胡萝卜素的总称，后者是含氧类胡萝卜素的总称，包括叶黄素、玉米黄质、α-胡萝卜素、紫黄质、隐黄质、辣椒红素等[6]。

早在20世纪80年代中期，西方医学界研究人员就发现：叶黄素在抗氧化、预防视网膜黄复病和白内障疾病、冠心病及人体衰老、增强机体免疫力等方面有着广泛的生物活性[7～9]。近年来，研究表明叶黄素还可预防和改善癌症、糖尿病、心血管疾病等多种慢性疾病[10～12]。鉴于叶黄素无毒安全，具有较强抗氧化、改善视力等生理功能，已被广泛应用于饲料添加剂、食品添加剂、保健食品、化妆品、医药、工业染料、水产品等行业[13]。

本研究采用以KOH和甲醇、异丙醇的三元混合溶剂为皂化液，同时采用超声波辅助的方法进行皂化反应得到叶黄素。在此基础上，利用响应面分析法对其提取工艺参数进行优化，得出超声波皂化叶黄素反应的最佳工艺条件，为进一步开发利用这一天然色素提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

万寿菊颗粒，由林甸县齐鑫天然产物有限公司提供；叶黄素标准样品购于Sigma公司。试剂：THF（四氢呋喃）、甲醇、KOH、无水乙醇、醋酸、正丁醇。

1.1.2 仪器

KQ5200DE超声波反应器（昆山市超声仪器有限公司）、Ⅲ性循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）、RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣仪器厂产品 ）、FA-1004电子分析天平（上海恒平科学仪器有限公司）、U-2001紫外分光光度仪（德国耶拿分析仪器股份公司）、HWS24恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）、FW-80万能粉碎器（北京市永光明医疗仪器厂）、DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱（扬州鸿都电子有限公司）、Surveyor高效液相色谱分析仪（美国Finnigan公司）、TGL-16B高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程

叶黄素酯→超声波辅助皂化→抽滤→调PH值→提取液浓缩→离心除去上清液→真空干燥→叶黄素。

1.2.2 操作方法

精确称取叶黄素浸膏5g，加入2倍体积的四氢呋喃溶解，待溶解后，加入一定量一定浓度的KOH-碱溶液进行超声波（功率100W）皂化，皂化结束后，抽滤，用20%醋酸水溶液调pH值至中性，将滤液真空浓缩至无馏出液，离心去除上清液，收集叶黄素，真空50℃干燥24小时，得到叶黄素晶体。注意尽量避光。

1.2.3 测定方法

提取率的测定：取0.1g叶黄素用正己烷定容到25mL，用1cm比色皿以正己烷作空白在波长450nm处测定的其吸光度值。

叶黄素含量的计算：

叶黄素含量（mg/g）=

式中：Y为样品溶液的定容体积（mL）；A为样品的吸光度值；

E■■为吸光系数，为在1cm光程长的比色杯中1%（w/v）浓度溶质的理论吸收值，取值2500。

2 结果与分析

2.1 不同配比液对皂化反应的影响

由于甲醇、乙醇对KOH的溶解性好[14]，但对万寿菊浸提物的分散性差，且乙醇易挥发，使得皂化反应不能在较高温度下进行；异丙醇、正丁醇对万寿菊萃取物的分散性较好，但对KOH的溶解性较差。而甲醇与异丙醇的相容性好，所以选择甲醇与异丙醇的混合体系为溶剂既对KOH有很好的溶解性，又对叶黄素酯有很好的分散性，从而很好满足了皂化需要。

表1 不同配比液对皂化反应的影响

由表1可知：当甲醇和异丙醇的体积比为4：1时，叶黄素含量最多，此时异丙醇已能很好分散叶黄素酯，异丙醇用量继续增大时，叶黄素含量没有明显提高，而且进一步增大异丙醇的用量会甲醇浓度下降，不利于溶解叶黄素酯，使得皂化反应不完全。故确定甲醇和异丙醇的最佳体积比为4：1。

2.2 超声波皂化反应单因素考察

2.2.1 碱溶液浓度对皂化反应的影响

图1 碱溶液浓度对皂化反应的影响

由图1可知：随碱浓度的增加，叶黄素的含量先增大后减小；当碱溶液浓度小于10%时，叶黄素酯分散性不好，影响皂化反应进行，使叶黄素含量低；当碱溶液浓度为10%时，叶黄素的含量达到最大值，继续增加溶液的体积分数，叶黄素含量略有下降。能是叶黄素在强碱环境易分解，不稳定[15]，使得叶黄素含量下降，故确定最佳料液比为10%。

2.2.2 碱溶液加入量对皂化反应的影响

图2 碱溶液加入量对皂化反应的影响

由图2可知：随着碱溶液加入量的增加，叶黄素含量先增大后减小；在碱加入量为150mL时，叶黄素的含量达到最大值。可能因为生成的游离叶黄素单体在强碱条件下不稳定进而影响含量[16]；加碱量过大不仅浪费试剂，而且在皂化反应过程中需要耗费大量的酸中和、去离子水洗涤，造成叶黄素损失，故确定最佳碱溶液加入量为150mL。

2.2.3 皂化温度对皂化反应的影响

图3 皂化温度对皂化反应的影响

由图3可知：随着皂化温度的增加，叶黄素含量先增大后减小；当皂化温度为50℃时，叶黄素含量达到最大值。当皂化温度大于50℃时，叶黄素的含量呈下降趋势。分析原因：其一，温度升高有利于脂类的溶解和碱液的分散，从而促进皂化反应的进行；其二，叶黄素的热稳定性较差，当温度过高时游离的叶黄素易被氧化，影响叶黄素的含量；故确定最佳皂化温度为50℃。

2.2.4 皂化时间对皂化反应的影响

由图4可知：随着皂化时间的增加，叶黄素的含量先增大后减小；当皂化时间为2h时，叶黄素含量最高；当皂化时间超过2h时，叶黄素含量又呈下降趋势。因为随着皂化时间的延长，叶黄素在碱性条件下易发生氧化降解和异构化[17]导致含量降低，故确定最佳皂化时间为2h。

2.3 响应面分析与工艺优化

2.3.1 叶黄素皂化反应综合试验方案和因素水平

利用SAS 9.1软件进行响应面试验设计[18]，选取KOH-碱溶液浓度、KOH-碱溶液加入量、皂化温度、皂化时间4个单因素进行显著性分析，采用四因素三水平的响应面分析方法，试验因素与水平设计见表2。

表2 因素水平编码表

2.3.2 响应面分析方案及结果

对叶黄素皂化工艺进行响应面分析，其具体试验方案见表3。

表3 二次回归旋转组合设计及实验结果

各因素的四元二次回归方程：

Y1=-6.86344+92.425*X1+0.014267*X2+0.423792*X3+4.7775*X4-228.5*X1*X1+0.0425*X1*X2-0.47*X1*X3-11.3*X1*X4-0.000068*X2*X2+0.000057*X2*X3+0.000725*X2*X4-0.003075*X3*X3-0.03025*X3*X4-0.4925*X4*X4

回归方程方差分析见表4可知：在一次项中，KOH-碱溶液浓度、KOH-碱溶液加入量、皂化温度和皂化时间对叶黄素均有显著性影响（P<0.05）。在交互项中，四个因素之间对叶黄素的含量也达到显著影响。而二次回归模型的F值为16.52，大于F（14，12）0.01=4.05，且P<0.0001，而失拟性的F值为24.94，小于F（10，2）0.01=99.40，决定系数R2=0.9507，表明该模型极显著。一次项，二次项F值均大于0.01水平上的F值，所以此回归方程是有效可用于设计范围内预测所用。

2.3.3因素间的交互影响结果

根据交互作用方程，用SAS9.1软件可以绘出Y14 、Y34的交互作用响应曲面和等高线方程。

（1）KOH浓度和皂化时间的交互响应曲面和二维等高线如图5所示：

图5 KOH浓度和皂化时间的响应面图和等高线图

如图5可知：当KOH-碱溶液加入量150ml，皂化温度是45℃时，KOH-碱浓度从6%向10%增大，而皂化时间从1.2h到2.1h也同时增大时，叶黄素的含量也是随着KOH-碱浓度和皂化时间的增加而增加的。当KOH浓度在10%时，皂化时间是2.1h时，两者的协同作用达到最大，叶黄素的含量达到最大值。当KOH浓度从10%到14%，提取时间从2.1h到3h时，万寿菊中叶黄素的含量随着KOH浓度和皂化时间的增加而减少，说明两者交互作用显著，得到较大的响应值。

（2）KOH-碱加入量和皂化时间的交互响应曲面和二维等高线如图6所示

图6 KOH-碱加入量和皂化时间的响应面图和等高线图

如图6可知：当KOH-碱浓度是10%，KOH甲醇加入量为150ml时，皂化温度从36℃向50℃增大，提取时间从1.2h到2.1h增大时，叶黄素的含量随着皂化温度和皂化时间的增加而增加。当皂化温度在50℃，皂化时间在2.1h时，两者的协同作用达到最大，叶黄素的含量达到最大值。当皂化温度在50℃到54℃时，皂化时间在从2.1h到3h时，万寿菊中叶黄素的含量随着皂化温度和皂化时间的增加而减少，说明两者交互作用显著，得到较大的响应值。

2.3.4 验证性试验结果

对回归方程模拟寻找最优值，结果如下表5所示：

表5响应面法优化结果的验证实验结果

由表5可知，在响应面法所预测的理论最佳提取条件下做三次验证实验，得出提取的叶黄素得率平均值为15.53%。综上所述，确定的达到叶黄素酯得率最大值的最优组合为：KOH浓度11%，KOH甲醇加入量170ml，皂化温度50℃，皂化时间2h。

3 结论

以叶黄素酯为原料，考察了KOH浓度、KOH甲醇加入量、皂化温度和皂化时间对叶黄素得率的影响，确定了单因素试验的最佳提取条件是：KOH-碱溶液浓度11%，KOH-碱溶液加入量170ml，皂化温度50℃，皂化时间2h。在单因素试验基础上，设计四因素三水平的二次旋转组合试验，并通过分析，优化万寿菊中叶黄素的超声波皂化工艺。确定最佳皂化条件为：KOH-碱溶液浓度11%，KOH-碱溶液加入量170mL，皂化温度50℃，皂化时间2h，此条件下叶黄素得率达到15.64 %。验证实验结果与模型预测值基本一致，说明此模型可依靠，对高纯度叶黄素的提取和工业化生产具有参考价值。

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02-252.

作者简介：李曼（1987.5-），女，学生，黑龙江八一农垦大学食品学院2011级在读研究生，食品科学专业。

*为通讯作者：梁英，女，黑龙江省宾县人，教授，博士，主要从事中草药有效成分提取分离与应用研究。