苦瓜叶片提取液对农杆菌生长抑制作用的初探

单少杰，李 翔，郭红梅，陈 宏

（天津师范大学a.生命科学学院，b.天津市动植物抗性重点实验室，天津300387）

苦瓜（Momordica Charantia L.）系葫芦科（Cucurbitaceae）苦瓜属（Momordica）攀缘性草本植物.多种古籍记载，苦瓜叶片具有治疗胃痛、痢疾、疗疮肿毒和驱虫等功效[1].近年来，有文献报道苦瓜果实提取物具有良好的广谱抗菌功效，对革兰氏阳性球菌（如金黄色葡萄球菌）、革兰氏阳性杆菌（如枯草杆菌）和革兰氏阴性杆菌（如大肠杆菌）等具有明显的抑菌效果[2-4].苦瓜叶片作为果实以外的副产物，虽然无法食用，但其提取物能够有效抑制某些农业害虫，如小菜蛾、斜纹夜蛾、美洲斑潜蝇等[5-7]，因此可以作为绿色环保的害虫抑制剂应用到农业生产中.目前研究多针对苦瓜叶片提取物对农业害虫的抑制作用，对菌类抑制作用的报道较少.

农杆菌（Agrobacterium）是一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌，生活在植物根表面，依靠由根组织渗透出来的营养物质生存.农杆菌吸附在植物根部后，将自身DNA导入到植物根部，被侵染的植物会出现根部膨大、生长缓慢、矮小等症状.

本研究以无水乙醇为萃取液，制备苦瓜叶片提取液并处理农杆菌，观测其生长情况.目的是为进一步研究苦瓜叶片的抗菌机制提供参考，也为其开发利用提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 供试菌种与植物

菌种：农杆菌，天津师范大学生命科学学院栾维江教授实验室提供.

植物：苦瓜（长丰三号），由天津市农业科学院蔬菜研究所提供种子，在天津市西青区精武镇种植.采收叶片，用去离子水洗净，真空干燥后保存备用.

1.2 实验方法

1.2.1 苦瓜叶片乙醇提取液的制备

具体制备方法参照文献[5].

1.2.2 液态培养基的制备

取250mL双蒸水，加入蛋白胨2.5g，酵母粉1.25g，氯化钠2.5g，以氢氧化钠调节pH至7.0，加热灭菌后，每4mL为1份，分装至试管中.每份加入4μL利福平抗生素，将制备好的液态培养基混匀，备用.

1.2.3 实验处理

将苦瓜叶片提取液设置4种质量浓度（3.1、6.3、12.5、25.0g/L），同时用清水（CK1）和乙醇（CK2）作为对照，共设6个处理，每个处理重复3次.分别在各处理组中加入制备好的液态培养基1份，同时接种农杆菌，将各处理菌液置于28℃、200r/min环境下培养.对菌液每12h进行1次吸光度值D（λ）600的测量.因苦瓜叶片乙醇提取液本身为绿色，为消除提取液自身颜色对吸光度的影响，另配制每个浓度下未接种农杆菌的培养基，测量吸光度值.最终测量值为含菌培养液的吸光度值减去不含菌培养液的吸光度值.

1.3 数据处理

以SPSS17.0统计软件对数据进行处理和方差分析.

2 结果与分析

根据在600nm处测得的培养基吸光度值的变化，可以看出不同处理浓度和不同时间农杆菌的生长情况，结果如表1所示.

表1 农杆菌培养液在不同时间的D（λ）600Tab.1 D（λ）600of cultivation liquid of Agrobacterium at different time

由表1可以看出，CK1和CK2处理组D（λ）600相近，都显著高于苦瓜叶片乙醇提取液中的D（λ）600.随着提取液浓度的增大，农杆菌培养液的D（λ）600呈下降趋势，但在6.3、12.5和25.0g/L 3个处理浓度下，培养液D（λ）600的差异没有统计学意义.

为了更清晰地分析苦瓜叶片提取液对农杆菌生长的影响，作生长曲线如图1所示.

图1 农杆菌的生长曲线Fig.1 Growth curves of Agrobacterium

从处理浓度上来看，在4个时间段中，苦瓜叶提取物质量浓度为3.1g/L的处理组与其余各处理组之间的差异均具有统计学意义（p≤0.05）.由图1可以看出，在处理12h时，质量浓度为3.1g/L的处理组与6.3、12.5、25.0g/L处理组之间就开始出现差异，同对照组相比，此时农杆菌的生长已受到抑制，证明该浓度即为抑制农杆菌生长的有效浓度.随着处理时间的延长，D（λ）600均逐渐增大，表明培养液中农杆菌数量逐渐增多.4个苦瓜叶提取物处理组的吸光度值均显著低于2个对照组，表明苦瓜叶提取物对农杆菌具有抑制作用.其中质量浓度为3.1g/L处理组的农杆菌生长曲线同其他处理组始终差别较大，而且随着作用时间的延长，差别也逐渐增大.其余3种浓度下农杆菌的生长曲线基本重合，由此可见，这3种浓度的苦瓜叶提取物对农杆菌的抑制效果近似.

从作用时间来看，对照组、质量浓度为3.1g/L处理组在4个时间段的菌液浓度始终呈上升趋势；质量浓度为6.3、12.5、25.0g/L的处理组在36h之前为农杆菌的快速生长期，36h和48h之间菌液浓度达到最大，这说明处理时间达到36h后，农杆菌数量趋于稳定.

由此表明，4个苦瓜叶提取物处理组中，质量浓度为3.1g/L的提取物开始对农杆菌产生显著的抑制效果，但抑菌能力出现大幅度变化的临界质量浓度为6.3 g/L，浓度再增大时，抑菌效果已没有显著提升.

3 结论

本研究表明，苦瓜叶片提取液确实可以有效抑制农杆菌的生长.在4个处理浓度中，以6.3 g/L为抑制农杆菌生长的最适处理浓度.在4个时间段中，以24h为最佳的处理时间.

[1] 李承祜.药用植物学[M].上海：科学出版社，1949.

[2] 张绪忠.苦瓜抗菌作用的研究[J].中草药，1995，26（10）：556-559.

[3]张瑞其，马廉兰，吕军华.苦瓜叶的抑菌试验[J].赣南医学院学报，2003，23（3）：272-273.

[4]王杰，张名位，刘兴华.苦瓜提取物的抑菌作用及其稳定性研究[J].食品科技，2004（4）：56-58.

[5] 郭红梅，陈波，陈宏，等.苦瓜叶片正丁醇萃取液对小菜蛾取食及生理特性的影响[J].天津师范大学学报：自然科学版，2013，33（1）：82-84.

[6] 骆颖，张茂新，凌冰.苦瓜叶乙酸乙酯萃取物对斜纹夜蛾消化酶活性的影响[J].环境昆虫学报，2012，34（3）：289-294.

[7] 凌冰，向亚林，张茂新，等.苦瓜叶提取物对美洲斑潜蝇取食和产卵行为的抑制作用[J].应用生态学报，2009，20（4）：836-842.