应用六重PCR方法对猪流产死胎病原的快速检测

梁海英，曾智勇，王伟丞，汤德元，刘 钊

（贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

母猪繁殖障碍性疾病是以母猪流产，产死胎、木乃伊胎、弱仔和畸形胎等为主要症状，其原因主要有两类：一类是非传染性因素，约占60%～70%；另一类是传染性因素，约占30%～40%[1]。在引起母猪繁殖障碍性疫病的传染性因素中，病毒性因素是目前最为主要的，如猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、乙型脑炎病毒（JEV）和猪细小病毒（PPV）等，这些病毒所致疾病症状相似[2]，都可以通过胎盘传播而感染胎儿，从而影响胎儿的生长和发育。为了尽量降低生产中由此带来的损失，建立上述病原的快速准确的检测方法尤其重要。

2014年8月3日，贵阳市某猪场初产母猪发生一起产死胎、弱仔的现象（图1），为确诊病原感染类型，实验选用了猪繁殖障碍性病毒性疫病六重PCR检测方法[3]，对该死胎病料进行了PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CFSV 和 JEV感染情况的快速检测。现将诊断过程报道如下。

图1 产死胎、弱仔的母猪

1 材料与方法

1.1 病料

贵州贵阳市某猪场送检的1头死胎。

1.2 参考序列与主要试剂

根 据NCBI公 布PRV gE（NC-006151）、PPV NS1（NC-001718）、PCV2 ORF2 (NC-005148）、PRRSV ORF5 (NC-001961)、CSFV E2（X87939）、JEV E(M55506)序列设计多重PCR引物；核酸提取试 剂 盒；PrimeScript One Step RTPCR Kit Ver.2.0。

1.3 引物的设计与合成

设计了检测PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CSFV和JEV的6对引物，预期的扩增目的片段长度为178 bp、271 bp、353 bp、433 bp、508 bp 和1 015 bp[3]。引物送上海生物工程有限公司合成。

1.4 病料处理

采集送检死胎的肺脏、脾脏、肾脏和淋巴结等组织置于乳钵中，剪碎后用PBS按1：5倍稀释研磨，制成乳悬液，-80 ℃反复冻融3次，8 000 r/min离心15 min，取上清于 -20 ℃保存备用。

1.5 病料中DNA/RNA的抽提

严格按TaKaRa公司核酸提取试剂盒说明书提取病料中的核酸[3]。

1.6 多重PCR反应

以病料核酸为模版进行多重PCR扩增。反应体系为50μL， 2×one Step Buffer 25μL， 核 酸 模 版 5μL，Prime Script one Step Enzyme Mix 2μL，上下游引物各1μL，共6对引物，RNase Free H2O 6μL。反应条件：50℃ 40 min；94℃ 5 min；94℃ 30 s ，57 ℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

应用已建立的六重PCR检测技术，对送检病料进行快速检测，扩增出了178 bp和353 bp左右大小的特异性条带（图2），结果表明送检死胎同时感染有PRV和PCV2两种病毒。据场主介绍，该猪场只进行过猪瘟、蓝耳病和口蹄疫疫苗的接种免疫，即该猪场未曾免疫PRV和PCV2疫苗。根据实验室病检测结果，结合流行病学分析，初步判断该母猪产死胎和弱仔的主要原因系这2种病毒混合感染所致，其中伪狂犬病病毒起主要作用。

PRV主要危害母猪和仔猪，感染种猪和所生仔猪可长期带毒，健康猪与发病猪或带毒猪直接接触可发生感染，引进带毒种猪是疫情扩散的主要原因。妊娠母猪感染PRV后常可造成垂直传播使病毒侵入胎儿，从而造成母猪流产和产死胎。目前，疫苗预防是防控PRV的主要措施，由于PRV只有1种血清型，使用疫苗可以控制该病的发生，应用最广泛的是PRV gE基因缺失疫苗，该疫苗效果较好，同时也方便实验室进行疫苗毒和野毒感染的鉴别诊断，因此建议规模化猪场所有母猪和种公猪都要接种PRV gE基因缺失疫苗。

图2 病料多重PCR扩增产物电泳结果

PCV2的主要传染源是病猪和带毒猪，水平传播是PCV2在猪群中传播的方式之一，此外，怀孕母猪感染PCV2后，也可经胎盘垂直传染给仔猪，并导致繁殖障碍。本次检测结果也再次表明PCV2是可经胎盘垂直感染的，提示种猪场应做好母猪的PCV2的免疫预防，这对控制仔猪圆环病毒2型感染尤为重要。自2006年PCV2疫苗商品化以来，疫苗免疫也是防控该病最重要的手段。PCV2疫苗的应用在一定程度上有效控制了PCV2感染，显著降低PCV2感染猪群的临床症状和提高猪的生长性能，但疫苗免疫不能完全阻断PCV2传播，也不能清除体内已感染的病毒。因此规模化猪场除免疫PCV2疫苗外，还需强化生物安全，加强饲养管理，改善猪场环境等这些基本措施。

[1] 王守栋，肖建森，曾勇庆，等. 母猪繁殖障碍的原因分析及综合防制[J]. 养猪，2013(2)： 45-48.

[2] 李春燕，王洪光，汤德元，等. 规模化猪场常见猪繁殖障碍病毒性疫病混合感染及其防制研究[J]. 猪业科学，2013，30(10)： 89-91.

[3] 刘志杰，曾智勇，汤德元，等.猪繁殖障碍病毒性疫病六重PCR检测方法的建立及应用[J].畜牧兽医学报 ，2012，43(9)：1429-1436.