基于傅里叶变换红外光谱法的土茯苓真伪鉴别及溯源研究

2014-02-13肖凤霞郑宇翔林靖然雷胄熙

食品科学 2014年12期

郑捷，肖凤霞，林励，郑宇翔，林靖然，雷胄熙

（广州中医药大学中药学院，广东广州 510006）

土茯苓为百合科植物光叶菝葜（Smilax glabraRoxb.）的干燥根茎，性味甘、淡、平。具有除湿、解毒、通利关节的功效。常用于湿热淋浊、带下、痈肿、瘰疬、疥癣、梅毒及汞中毒所致的肢体拘挛、筋骨疼痛[1]。当前，土茯苓不但在临床上作为药品广泛使用，在生活和生产中也较多的作为食品或食品原料使用，在南方常被用作汤羹材料。随着人们饮食保健意识的加强，原属广东、广西地区食用龟苓膏的习惯己被越来越广区域的人们接受，进一步扩大了土茯苓的市场需求量。由于各地使用土茯苓的历史沿革不一致，导致市场上长期出现以其他菝葜属、肖菝葜属及薯蓣科的部分植物作代用品[2]。菝葜属、肖菝葜属部分植物及饮片的外观性状与土茯苓与极为相似，从外形上鉴别区分比较困难，不法商贩常以相对更加廉价易得的金刚藤等冒充土茯苓出售，谋取利益[3]。近年报道的液相指纹图谱鉴别、薄层鉴别等方法都存在着鉴别时间长、破坏样品等较多问题，因此，针对目前土茯苓混用严重及饮片等级难以划分的现状，迫切需要建立有效的土茯苓真伪及品质鉴别、溯源控制方法。

傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）分析法，可以反映药材化学成分的整体信息[4-5]，可快速鉴别药材及各类食品[6-10]，红外光谱结合统计学分析方法，如聚类分析、主成分分析等，可为大量药材及食品的质量控制提供较好的解决方案[11-15]。本研究选取15 批市售土茯苓样品、10 批金刚藤样品及5 批粉萆薢样品，利用FTIR并结合聚类分析、二阶导数图谱[16-20]等方法，对其红外指纹图谱进行分析处理，以期建立一种土茯苓真伪及品质鉴别、溯源监控的有效方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

KBr（光谱纯，批号：20120109）国药集团化学试剂有限公司；土茯苓及其常见混用品均来自市售（表1），各样品均经广州中医药大学高明副教授鉴定，其中土茯苓为百合科（Liliaceae）植物光叶菝葜的干燥根茎，金刚藤为百合科植物菝葜（Smilax chinaL.）的干燥根茎，粉萆薢为薯蓣科植物粉背薯蓣（Dioscorea hypoglaucaPalibin.）的干燥根茎。药材标本存放于广州中医药大学实验管理中心。

表1 样品来源及种类Table 1 Sources and types of samples

1.2 仪器与设备

Avatar360傅里叶变换红外光谱仪、DTGS检测器美国Nicolet公司；FW-4/4A型压片机、HF-2红外压片模具天津光学仪器有限公司；BS110S电子分析天平美国Sartorius公司；DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司；DFY-200摇摆式高速中药粉碎机温岭大德中药机械公司；玛瑙研钵天津天光光学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品测定与仪器条件

样品粉碎，分别在60 ℃干燥至恒质量，过80 目筛，备用。精密称取样品粉末约2 mg、KBr约150 mg，在红外光灯下混合研磨，均匀放入模具内，压强为16 MPa时维持1 min进行压片。光谱范围4 000～400 cm－1，扫描信号累加32 次（扣除H2O、CO2干扰），分辨率4 cm－1。

1.3.2 数据预处理

每个样品测定3 次，然后将各次测得的光谱曲线加和取平均得到数据曲线，所有图谱吸光度均经过13点平滑、自动基线矫正和纵坐标标准化处理。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 精密度

取同一样品供试片（土茯苓-致信100101）连续测定5 次，用Matlab 7.0软件计算相似度，测得的红外图谱与其所得共有模式图谱的相似度分别为1.000 0、0.992 1、0.992 0、0.991 3、0.990 9，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.382 6%。

2.1.2 重复性

取同一样品（土茯苓-致信100101），分别取样5 次进行压片测定，用Matlab 7.0软件计算相似度，测得的红外图谱与其所得共有模式图谱的相似度分别为1.000 0、0.991 5、0.988 2、0.986 6、0.979 1，RSD为0.769 4%。

2.1.3 稳定性

取同一样品片（土茯苓-致信100101）放入干燥器内保存，分别放置0、1、2、3、4、24 h后测定，用Matlab 7.0软件计算相似度，测得的红外图谱与其所得共有模式图谱的相似度分别为1.000 0、0.991 9、0.981 2、0.967 3、0.954 1和0.940 1，RSD为2.39%。

2.2 一维红外指纹图谱分析

2.2.1 指纹图谱建立

图1 15 批土茯苓一维红外图谱叠加图Fig.1 Overlapped infrared spectra of 15 batches of Smilax glabra Roxb.

图2 10 批金刚藤一维红外图谱叠加图Fig.2 Overlapped infrared spectra of 10 batches of Smilax china L.

图3 5 批粉萆薢一维红外图谱叠加图Fig.3 Overlapped infrared spectra of 5 batches of Dioscorea hypoglauca Palibin.

将处理好的土茯苓、金刚藤及粉萆薢样品分别压片，按照1.3.1节方法进行实验，以波数为横坐标，吸光度为纵坐标，土茯苓样品一维红外光谱叠加图见图1，金刚藤样品一维红外叠加图见图2，粉萆薢样品一维红外叠加图见图3。

2.2.2 共有峰的确定

通过对15 批土茯苓样品进行红外光谱分析与比较，确定10 个共有峰作为土茯苓红外指纹图谱的共有峰，分别为523、575.1、856.6、978.2、1 160.8、1 369.4、1 638.9、2 930.3、3 176.8、3 599.0 cm－1；对10 批金刚藤样品进行红外光谱分析与比较，确定9 个共有峰，峰波数分别为569.3、852.6、975.3、1 161.4、1 461.8、1 635.2、1 732.6、2 921.7、3 415.2 cm－1；对5 批粉萆薢样品进行红外光谱分析与比较，确定7个共有峰，峰波数分别为861.0、1 017.6、1 241.0、1 368.7、1 656.4、2 921.2、3 327.38 cm－1。结果显示，金刚藤在856.0、975.0、1 160.0、1 636、2 921 cm－1峰波附近与土茯苓样品具有相似的波峰特点，说明土茯苓与同科植物金刚藤化学成分存在一定的相似之处；粉萆薢则仅在1 368、2 925.5 cm－1峰波附近处与土茯苓样品存在重合，提示土茯苓与粉萆薢化学成分差异较大。

2.2.3 相似度评价

从图1～3可以看出，15 批土茯苓之间、10 批金刚藤之间的红外光谱大体相似，5 批粉萆薢之间的红外光谱相似度也极高。用Matlab 7.0软件分别计算不同药材的相似度，并建立其共有模式见图4～6。15 批土茯苓样品指纹图谱与其共有模式图谱（图4）的相关系数（中位数）在0.962 4～0.991 8之间，说明所建立的红外指纹图谱方法具有较高的代表性，其中广东产地的7批样品之间及广西产地6 批样品之间相似度极高，相似性都在0.990 1以上；10 批金刚藤样品指纹图谱与其共有模式图谱（图5）的相关系数（中位数）在0.976 5～0.994 5之间；5 批粉萆薢样品指纹图谱与其共有模式图谱（图6）的相关系数（中位数）在0.986 3～0.994 5之间。

图4 15 批土茯苓红外光谱共有模式Fig.4 Common FTIR fingerprint patterns of 15 batches of Smilax glabra Roxb.

图5 10 批金刚藤红外光谱共有模式Fig.5 Common FTIR fingerprint patterns of 10 batches Smilax china L.

图6 5 批粉萆薢红外光谱共有模式Fig.6 Common FTIR fingerprint patterns of 5 batches of Dioscorea hypoglauca Palibin.

2.2.4 土茯苓与金刚藤、粉萆薢的聚类分析

表2 30 个样本的聚类分析结果Table 2 Cluster analysis of 30 samples

根据15 批土茯苓样品及15 批常见混淆品的红外图谱分析结果，以各峰位的波数为变量，以各峰透光率为测度，通过SPSS 17.0统计分析软件进行Q型聚类分析，分析结果如表2。15 批土茯苓样品及混用品被聚为3大类，其中10 批土茯苓样品聚为1类，10 批金刚藤样品及5 批粉萆薢样品各聚为1类，这也很好地解释了相似度分析的结果，说明通过聚类分析法也可以对土茯苓样品及其混用品做出有效的区分鉴别。

2.2.5 土茯苓与金刚藤、粉萆薢红外图谱对比分析

从样品一维红外光谱图及共有峰上可以看出，土茯苓与金刚藤、粉萆薢间的一维红外图谱整体特点、主要吸收峰及各自共有峰均差异较大，尤其在1 800～400 cm－1信息量较大的波数段，土茯苓与金刚藤、粉萆薢差异明显，此区域内3 种药材间吸收峰的峰位及相应的吸光度存在较大差异。如金刚藤在1 730、1 630 cm－1处吸收峰有明显强弱对比，且基本强于1 500～1 200cm－1处吸收峰，土茯苓则无此特征；粉萆薢与土茯苓在1 800～400 cm－1区域内吸光度强弱对比差异明显。另外，土茯苓样品在3 660、2 930 cm－1处有明显的吸收峰，金刚藤样品则在3 410 cm－1附近有明显吸收峰，而粉萆薢在3 000 cm－1处有明显吸收。根据红外光谱特征及各自特征吸收峰，可快速、有效地对3 种药材进行鉴别。

2.3 土茯苓二阶导数图谱分析

图7 6 批广西土茯苓二阶导数红外光谱（1 800～1 200 cm－1）Fig.7 Second derivative spectra of 6 batches of Smilax glabra Roxb.from Guangxi autonomous region (1 800–1 200 cm－1)

图8 7批广东土茯苓二阶导数红外光谱（1 800～1 200 cm－1）Fig.8 Second derivative spectra of 7 batches of Smilax glabra Roxb.from Guangdong province (1 800–1 200 cm－1)

利用一维红外图谱上可以较好地实现土茯苓与其常见混淆品的区分鉴别；但对于不同来源的土茯苓药材，其差别在一维红外图谱上基本不能体现，利用土茯苓红外图谱1 800～1 200 cm－1波数段丰富的信息并结合二阶导数图谱进行分析，可实现土茯苓产地区分鉴别，同时为土茯苓的溯源研究提供参考。

以一维红外图谱相似度最高的广东、广西产地为例，与广东7 个来源的土茯苓相比，广西产地土茯苓二阶导数图谱在1 800～1 200 cm－1（尤其在1 600～1 400 cm－1，见图7、8中方框位置）波数段内峰位、峰强、峰形、峰数的差异明显；其中，在1 640、1 467、1 446 cm－1附近两产地土茯苓差异尤其明显。利用上述两产地的不同光谱特征，可实现对广东、广西两个不同省区产地土茯苓的区分鉴别，并为其溯源识别研究提供了参考。

3 结论

根据红外一维指纹特征可很好地快速区分土茯苓及其常用混淆品金刚藤、粉萆薢，本实验建立的方法准确、快速、稳定，可为土茯苓的合理使用及质量控制提供参考依据。另外，对产自广西、广东两省内不同来源的土茯苓样品的红外二阶导数图谱特征进行了分析，找出两省区土茯苓的红外二阶导数图谱差异性特征，根据这些特征，实现了对若干广西、广东产地的土茯苓样品的有效区分及识别，为土茯苓红外溯源研究提供了参考。

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