顶空固相微萃取与气相色谱-电子捕获技术联用检测软木塞中2,4,6-三氯苯甲醚

张哲琦，王玉春，陈 臣，李 艳,3,

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018；2.河北省分析测试研究中心，河北 石家庄 050018；3.河北省发酵工程技术研究中心，河北 石家庄 050018）

葡萄酒质量的好坏在很大程度上取决于它特有的风味，然而，许多葡萄酒由于2,4,6-三氯苯甲醚（2,4,6-trichloroanisole，TCA）的污染，使得其散发出一种霉味，从而大大的影响了酒的品质[1]。据估计，每年因为TCA的污染，使葡萄酒行业损失达100亿 美元甚至更多[2-3]。然而，葡萄酒中大部分TCA都是由软木塞中的TCA迁移进酒中[4]。研究表明，软木塞中的TCA是栎树生长和软木塞加工过程中霉菌降解环境中的2,4,6-三氯苯酚转化成的TCA[5]。因此，准确地检测出软木塞中TCA含量并去除，可确保葡萄酒的风味质量。

美国食品药品监督管理局的研究报告表明，消费者不可接受的TCA阈值水平一般在3.1 ng/L[6]。检测TCA，样品前处理的方法很多，包括固相萃取[7]、超声波辅助萃取[8]、液-液萃取[9]等，这些方法都较为繁琐[10]。顶空固相微萃取技术（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）是目前应用最广、最易操作的方法。该方法选择性高、耗时短、回收率高，不需要大量的有机溶剂就能够完成TCA的检测分析[11-16]。另有研究指出，气相色谱-电子俘获检测器（gas chromatography with electron-capture detection，GC-ECD）广泛用于检测TCA，与其他检测器相比精准度更高更灵敏[17]。本研究拟建立采用GC-ECD检测葡萄酒软木塞中TCA含量的方法，并有效地对软木塞中的TCA含量进行检测分析。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

11 种软木塞浸泡液 石家庄市百博贸易有限公司。TCA（纯度99%） 美国Aldrich公司；内标物2,4-二氯苯甲醚（2,3-dichloroanisole，DCA，纯度99%）、氯化钠（分析纯） 天津希恩思生化科技有限公司；乙醇（色谱纯，纯度99.9%） 韩国德山药业工厂；实验用水为超纯水，由明澈-D 24UV超纯水机制备。

CP-3800气相色谱仪（配电子俘获检测器） 美国Varian公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器、20 mL顶空瓶、涂有聚四氟乙烯螺旋盖 德国CNW公司；手动固相微萃取手柄、磁子及100 μm聚二甲基硅氧烷涂层萃取头 美国Sigma公司。

1.2 方法

参照国际标准化的方法[18]进行TCA萃取与检测。

1.2.1 标准品制备

TCA标准品的制备：用色谱级乙醇制备10－2g/L的TCA标准液，然后再用12%乙醇溶液逐级稀释成10－4g/L和4×10－7、8×10－7、15×10－7、25×10－7、50×10－7g/L的使用液。

DCA标准品的制备：用色谱级乙醇制备10－2g/L的DCA标准液，再用12%乙醇溶液稀释成10－4g/L的使用液。

1.2.2 萃取方法

向20 mL顶空瓶中加入3.00 g的氯化钠固体，准确吸取9.8 mL的12%乙醇于顶空瓶中，再向其分别加入100 μL TCA使用液和DCA使用液，加入磁子，拧紧瓶盖。将其放置在35 ℃恒温磁力搅拌器中。将转速调至1 750 r/min，将萃取针插入顶空瓶中，平衡15 min，推出萃取头，萃取25 min后拔出萃取针，立即移至气相色谱进样口处，解吸3 min。

1.2.3 气相色谱条件

色谱柱HP-5石英毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；氮气流速1 mL/min；进样口温度260 ℃，检测器温度280 ℃，不分流进样。升温程序：50 ℃保持2 min，以9.0 ℃/min的速率升至150 ℃保持2 min，再以20.0 ℃/min的速率上升至260 ℃保持5 min。

1.2.4 软木塞浸泡液的制备

在100 个软木塞中随机挑选5 个，将其放在250 mL的广口瓶中，然后倒入已配制好的12%乙醇溶液，直到将所有软木塞浸没，24 h后将浸泡液倒出。

2 结果与分析

2.1 TCA的保留时间

GC-ECD对含有卤素的化学物质具有很高的灵敏性，对于TCA的检测GC-ECD是很好地选择，但是它不能像气相色谱-质谱联用一样直接对TCA进行定性分析。因此，本方法测定0、4 ng/L和8 ng/L 3 个不同质量浓度的TCA标准品，从而确定TCA的保留时间，结果见图1。由图1可见，3 个不同质量质量浓度TCA标准品的保留时间相同，只是峰面积随质量浓度而变化，因此可以确定TCA的保留时间为（10.27±0.05）min。

图1 不同质量浓度的TCA保留时间色谱图Fig.1 Retention times of TCA at various concentrations

2.2 线性实验

以12%乙醇为基质，准确加入TCA和DCA使用液，使TCA的最终质量浓度分别为0、4、8、15、25 ng/L和50 ng/L，同时DCA的质量浓度保持不变，均为10－6g/L。按照HS-SPME的方法对这几种标准溶液进行萃取。经GCECD分析后，以TCA的峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标，制作标准曲线。标准曲线的线性方程为：y=20 302x+5 976.7，R² =0.999 9，线性范围为0～50 ng/L。由此可以看出，该方法测定TCA含量，可以得到很好的线性关系。

检出限和定量限分别定义为：a+3sa/b和a+10sa/b，式中：a为原点纵坐标的值，b为斜率，sa为原点纵坐标的方差[19]。因此，检出限为0.20 pg/L，定量限为0.66 pg/L。

2.3 准确度与精密度实验

准确度是指分析测定结果与真实值或参考值之间接近的程度，常常用回收率的结果来评价方法的准确度[20]。通常会用两种方法测定回收率，即空白加标回收率和样品加标回收率。本实验采用了样品加标回收率，即向处理好的软木塞浸泡液中分别添加3 种不同质量浓度的TCA标准液，分别是4、8、15 ng/L，每个质量浓度做3 次平行。同时，采用相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）表示方法的精密度，结果见表1。

表1 TCA检测方法的回收率和精密度（n=3）Table 1 Recoveries and precision (RSD) of TCA (n=3)

由表1可以看出，所测得回收率在101%～108%之间，RSD不大于5.6%，说明该方法的准确度和精密度都比较好。

2.4 软木塞样品中TCA含量的检测

采用所建立的检测方法对11 种不同类型的葡萄酒软木塞进行了测定，检测结果是每种软木塞浸泡液最少平行测定3 次所得结果，见表2。

表2 葡萄酒软木塞中TCA含量的测定（n=3）Table 2 Results of TCA determination in different kinds of wine corks (n=3)

由表2可以看出，葡萄酒软木塞中TCA的含量在发霉的原料中较高，制得成品的加工过程中含量下降，成品软木塞中TCA含量（4～11号样品）均在4 ng/L以下，普通消费者感知不到该质量浓度的TCA。本实验所建检测方法可以测得软木塞中痕量的TCA，且RSD均在10%以下，证明该方法的精密度较好。

3 结 论

随着葡萄酒与软木塞行业的发展，软木塞的污染问题也越来越受到人们的关注，TCA的检测也受到了全球各国的关注[9]。基于此现状，本研究建立了一种利用HS-SPME和GC-ECD测定葡萄酒软木塞中TCA含量的方法。该方法的线性关系好（R² =0.999 9）、回收率高（101%～108%）、精密度好（RSD不大于5.6%）。由于GC-ECD的高灵敏性，因此该方法的检出限低于TCA的阈值范围，所得到的检出限为0.20 pg/L，定量限为0.66 pg/L。检测11 种软木塞中TCA含量验证该方法，可以检出相当低含量的TCA，适用于软木塞中痕量TCA的检测，为未来我国对TCA检测标准的制定和含量监控提供了一种参考方法。该方法与国内外许多研究结果较为一致[1,8,13,21]，且灵敏性更高。同时，该方法避免了使用大量的有机溶剂，节省时间，因此是一种行之有效地检测葡萄酒软木塞中TCA含量的方法。

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