1株高效降胆固醇乳酸菌的功能与发酵特性

靳志敏，通力嘎，段 艳，贾雪晖，刘夏炜，王德宝，靳 烨

（内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古 呼和浩特 010018）

随着人们生活水平的提高、肉品加工技术的不断改进和冷藏工艺的出现，人们生活节奏的不断加快，营养知识的逐渐普及，发酵香肠越来越受到人们的青睐[1]。羊肉作为一种优良的畜肉，在世界各国都有着悠久的食用历史。同时，肉制品中含有大量的胆固醇，而血清中的胆固醇被认为是诱发冠心病、动脉粥样硬化等心血管疾病的重要危险因素[2]。

自然界中乳酸菌大量存在于发酵制品中，国内外均有大量研究发现乳酸菌在体内降低血液中胆固醇含量1%，即可降低心血管病的发病率2%～3%[3]。大量研究发现人们经常食用发酵制品具有降低人体血清胆固醇的作用[4]。为此，人们对乳酸菌开展了体内外降解胆固醇研究，旨在开发功能性乳酸菌制品，满足人们健康的需要。因此研究降胆固醇性能优良的菌株，对于开发功能性发酵制品、丰富现有发酵制品的种类、提高发酵制品的附加价值以及在食品加工中都具有重要的现实意义。

本实验进一步研究经初步筛选得到的胆固醇降解率较好的乳酸菌的降胆固醇特性，为筛选性能优良的乳酸菌作发酵香肠发酵剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株与培养基

菌株：内蒙古农业大学食品科学与工程学院保存的经初步筛选得到的1株具有降胆固醇性能的乳酸菌X3-2B；标准菌株：植物乳杆菌（L.plantarum，LP） 广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心，a2m1.191。

MRS-THIO培养基：MRS培养基中添加0.2 g/100 mL牛胆盐和0.2 g/100 mL巯基乙酸钠；胆固醇筛选培养基：MRS-THIO培养基中添加2%无菌胆固醇溶液（1.0 g/100 mL）[5]；模拟肉汤-CHOL培养基：模拟肉汤液体培养基中添加0.2 g/100 mL牛胆盐和0.2 g/100 mL巯基乙酸钠，121 ℃灭菌15 min后，添加2%无菌胆固醇溶液（1.0 g/100 mL）；MRS＋6 g/100 mL NaCl＋150 mg/kg NaNO2-CHOL培养基：MRS-THIO培养基中添加6 g/100 mL NaCl 和150 mg/kg NaNO2，121 ℃灭菌15 min后添加2%无菌胆固醇溶液（1.0 g/100 mL）。

1.2 试剂与仪器

牛胆盐 广东环凯微生物科技有限公司；巯基乙酸钠 广东环凯微生物科技有限公司；胆固醇 美国Sigma公司；BioSenTec Lot：28-12091胆固醇检测试剂盒南京建成生物工程研究所。

ZHJH-C1214C超净工作台 南京依贝仪器设备有限公司；YXQ-LS-SⅡ立式压力蒸汽灭菌锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；T6新世纪紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；胴体肌肉pH值直测仪 武汉恒绿食品技术有限公司；HD-3A型智能水分活度计测量仪 无锡市华科仪器仪表有限公司；TCP2型全自动测色色差计 北京奥依克光电仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株降胆固醇性能的测定

将各菌株于液体MRS培养基中活化3代后按2%接种量接于胆固醇筛选培养基中，培养24 h后于12 000 r/min离心10 min后，取上清液0.5 mL用邻苯二甲醛比色法测定其胆固醇含量[6-8]。实验重复3次取平均值。

1.3.1.1 不同温度对胆固醇降解能力的影响

将菌株于液体MRS培养基中活化3代后按2%接种量接种于液体胆固醇筛选培养基中，分别于4、10、15、25、30、45 ℃培养24 h，以不接种培养基为对照测定其胆固醇含量，实验重复3次取平均值，计算其胆固醇降解率[9]。

1.3.1.2 不同pH值对胆固醇降解能力的影响

将菌株于液体MRS培养基中活化3代后按2%接种量接种于pH 3.5、4.5、5.5、6.0的液体胆固醇筛选培养基中，培养24 h以不同pH值的不接种培养基为对照，测定其胆固醇含量，实验重复3次取平均值，计算其胆固醇降解率[4]。

1.3.1.3 不同培养基中胆固醇降解能力

将菌株于液体MRS培养基中活化3代的菌株以2%接种量接种于液体胆固醇筛选培养基、模拟肉汤-CHOL培养基、MRS＋6 g/100 mL NaCl＋150 mg/kg NaNO2-CHOL培养基中[4]，培养24 h后测定其胆固醇含量，实验重复3次取平均值，计算胆固醇降解率。

1.3.2 菌株在发酵香肠中的应用

以内蒙古苏尼特羊后腿肉与背部脂肪按肥廋比为20∶80制作3组发酵香肠：第1组（对照组）：以环境中自然菌株做发酵剂；第2组：以X3-2B为发酵剂；第3组：以标准菌株LP为发酵剂。分别在发酵香肠0、3、6、9、14 d时测定各组发酵香肠乳酸菌数、细菌总数、水分活度、pH值、色差值，并用胆固醇检测试剂盒测定其0、14 d时各组香肠胆固醇含量[10-11]。其中，色差：L*表示亮度，L*=100为白，L*=0为暗；L*值越大，色泽越白。a*＞0表示红色程度，a*＜0表示绿色程度。b*＞0表示黄色程度，b*＜0表示蓝色程度。

1.4 数据分析

用SPSS17.0软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的功能特性

2.1.1 不同培养温度对菌株降胆固醇性能的影响

图1 不同培养温度对菌株胆固醇降解率的影响Fig.1 Cholesterol degradation efficiencies at different temperatures

由图1可知，不同培养温度对菌株胆固醇降解能力有一定影响，菌株在30 ℃时胆固醇降解能力与4、10、15 ℃条件下胆固醇降解能力差异显著（P＜0.05），与25 ℃和45 ℃时胆固醇降解能力差异不显著。在相对较低温度（4、10、15 ℃）条件下培养的菌株其胆固醇降解能力差异不大，都为30%左右，30 ℃时菌株胆固醇降解能力最大。菌株在30 ℃时，生长能力较好及产酸能力较强，会产生游离胆酸，胆固醇和游离胆酸共沉淀，使胆固醇含量降低，而在温度较低或较高时，菌株生长能力较弱，培养基中胆固醇略有下降是由菌体细胞的吸收作用引起的[12]。

2.1.2 不同酸度对菌株降胆固醇性能的影响

图2 不同pH值对菌株胆固醇降解率的影响Fig.2 Cholesterol degradation efficiencies at different pH levels

由图2可知，菌株X3-2B在培养基pH值为5.0、5.5、6.0时胆固醇降解能力显著高于培养基pH值为3.5、4.5（P＜0.05）时，且当培养基pH 5.5时胆固醇降解能力最大。有研究[13-14]表明，乳酸菌在体外培养条件下，较低的pH值会提高其胆盐水解能力，从而形成游离胆酸，与胆固醇发生共沉淀，从而降低胆固醇含量，但pH值太低会抑制菌株生长，从而pH 5.5时菌株胆固醇降解能力较好[15]。

2.1.3 不同培养基对菌株降胆固醇性能的影响

图3 不同培养基对菌株胆固醇降解率的影响Fig.3 Cholesterol degradation efficiencies in different media

由图3可知，不同培养基中同一菌株胆固醇降解率差异不显著（P＞0.05），菌株X3-2B在不同培养基中胆固醇降解大于标准菌株LP在不同培养基中的胆固醇降解率，且各株菌在MRS培养基中胆固醇降解率最大。各培养基中营养成分的不同使得菌株在各培养基中生长能力不同，导致其在各培养基中的胆固醇降解能力不同。

2.2 乳酸菌在发酵香肠中的发酵特性

发酵肉制品是指腌制肉经过微生物发酵作用，产生特殊的风味、色泽和质地，并具有较长保存期的肉制品。发酵剂乳酸菌可降低pH值，减少腐败，改善制品组织状态，且具有降低胆固醇的益生功能。

2.2.1 菌株对发酵香肠中微生物的影响

由表1可知，各个时间段细菌总数与乳酸菌数差别不大，可知发酵香肠在发酵、成熟、干燥、贮藏等阶段乳酸菌起着关键作用。在发酵香肠做作的相同阶段，X3-2B组与LP组的乳酸菌数高于对照组，在发酵6 d时乳酸菌数分别为8.23、8.62（lg（CFU/g）），这与Ambrosiadis等[16]的研究结果相一致。通过接种发酵剂，使乳酸菌在发酵香肠中迅速生长。发酵期由于适宜的温度、pH值和湿度，菌数总数与乳酸菌数迅速增高，随着时间的延长，到干燥成熟期香肠低pH值、低温和不断降低的水分活度抑制了细菌的生长，成熟后期细菌总数均不断降低。

表1 菌株对发酵香肠中微生物的变化Table 1 Variations in bacterial quantities in fermented sausages

2.2.2 菌株对发酵香肠水分活度、pH值的影响

表2 发酵香肠水分活度与pH值变化Table 2 Variations in aw and pH in fermented sausages

由表2可知，发酵香肠水分活度随发酵时间的增加而逐渐减少，各实验组不同天数之间水分活度差异显（P＜0.05）。X3-2B组在发酵香肠各个阶段其水分活度显著低于对照组，水分活度下降速度较快。X3-2B组与LP组在加工各个阶段其pH值显著（P＜0.05）低于对照组，且X3-2B组在发酵结束阶段（0～3 d）pH值速迅降低到4.7，然后缓慢增加，而LP组3～6 d时pH值速迅降低到5.0后缓慢增加，可知菌株X3-2B在肉品中的产酸性能优于标准菌株。发酵香肠水分活度的下降与pH值呈直线关系，且随着发酵香肠pH值的降低，其水分活度也呈下降趋势，但pH值对水分活度的影响较小[17]。故菌株X3-2B产酸性能优良，发酵迅速，能快速降低发酵香肠pH值。

2.2.3 菌株对发酵香肠色差的影响

由表3可知，不同实验组在发酵3 d与6 d时色差值差异不显著（P＞0.05），与对照组相比，加发酵剂组的发酵香肠a*值与b*值小于对照组，颜色更红更饱满。在对发酵香肠色泽的评价中，b*值的不同单纯测定发酵香肠的a*值并不能完全评价人们的观察结果，因此采用a*/b*值来比较红色，更能贴切地反映出人们对红色的感官评价。a*/b*值越大，表现出的红色越鲜艳[18]。在发酵香肠制作的各个阶段，各组发酵香肠明度值L*、红度值a*与黄度值b*都呈先下降后增加的趋势。

表3 发酵香肠色差变化Table 3 Variation in color parameters in fermented sausages

2.2.4 发酵香肠胆固醇含量

表4 发酵香肠胆固醇含量Table 4 Cholesterol content in fermented sausages mg/100 g

由表4可知，加发酵剂组的发酵香肠中胆固醇含量显著降低（P＜0.05），而对照组中胆固醇含量无显著变化，且标准菌株在肉中的胆固醇降解能力稍强于菌株X3-2B。这与Stajić等[19]制作的猪肉发酵香肠中胆固醇含量变化情况相吻合，其在第14天时各组发酵香肠胆固醇含量差异不显著。在贮存28 d与56 d时，X3-2B组发酵香肠中胆固醇含量显著降低（P＜0.05），到56 d时胆固醇含量为52.83 mg/100 g，LP组发酵香肠中2周后胆固醇含量没有显著性变化。在发酵香肠贮存56 d时，X3-2B组发酵香肠中胆固醇含量最低。工业生产中胆固醇含量一般在58.48～105.24 mg/100 g[19-20]之间，由此可知，菌株X3-2B对肉中胆固醇降解性能较优良。

3 结 论

菌株X3-2B在培养温度为30 ℃，pH值为5.5时胆固醇降解能力最强。在不同培养基中，菌株胆固醇降解率大于标准菌株LP，且各菌株在MRS胆固醇培养基中的胆固醇降解率最大。

菌株X3-2B在发酵香肠加工适应温度（15～25 ℃）、适应pH值（5.0～6.0）条件下，有较好的胆固醇降解率，且发酵香肠水分活度、pH值、色泽与乳酸菌数都优于对照组，在贮存56 d时发酵香肠胆固醇含量低于对照组与LP组。

综上所述，菌株X3-2B降胆固醇性能、功能特性与发酵特性优良，故可作为1株功能、发酵特性优良的肉制品发酵剂。

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