云南松松塔中原儿茶酸提取工艺的研究

吴道勋，刘 璐，王 莹，刘 熙，张海珠*

（1.大理学院药学与化学学院，云南大理 671000；2.云南省昆虫生物医学研发重点实验室，云南大理 671000）

云南松松塔中原儿茶酸提取工艺的研究

吴道勋1，2，刘 璐1，2，王 莹1，2，刘 熙1，2，张海珠1，2*

（1.大理学院药学与化学学院，云南大理 671000；2.云南省昆虫生物医学研发重点实验室，云南大理 671000）

目的：优化云南松松塔中原儿茶酸的提取工艺。方法：以不同溶剂对云南松松塔中原儿茶酸的提取效率为指标，用高效液相色谱法进行含量测定，采用L9（34）正交设计试验以确定最佳提取工艺。结果：最佳提取工艺：以乙酸乙酯为提取溶剂，加入0.1 mol/L的HCl 3 mL，料液比为1∶40（mg/mL），超声时间90 min，超声温度40℃。结论：优化后的提取工艺简单、稳定、提取率高。

云南松；松塔；原儿茶酸；正交试验

松塔（Pinecone）系松科（Pinaceae）松属（Pinus）植物的球果，别名松实、松元、松果、松球，其植物来源有华山松、云南松、红松、油松及思茅松等〔1〕，松塔提取物具有抗肿瘤、抗HIV、抗炎、抗菌、增强免疫力等功效〔2〕，而分布在云南的云南松（Pinus yunnanensis Faranch）资源十分广泛，其松塔主要被当做燃料使用。

现代药理实验表明，原儿茶酸具有抑制黑色素生成的作用〔3〕、对大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用〔4〕等多种药理活性。文献报道云南松松塔中含有原儿茶酸〔5〕，且云南松分布广泛，因此选择松塔为试材对云南松松塔中原儿茶酸的提取工艺进行考察研究，以期为云南松松塔药材的开发利用及原儿茶酸的来源提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.2 主要仪器 Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；AL104电子分析天平（梅特勒一托利多仪器有限公司）；KQ5200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪有限公司）；旋转蒸发仪RE-3000（上海亚荣生化仪器厂）。

1.1.3 主要试剂 原儿茶酸对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-11103006）；流动相甲醇为色谱纯（Merck公司）；其余试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 对照品溶液的配制 精密称取原儿茶酸对照品4.957 mg，置于5 mL容量瓶中，加浓度为甲醇溶解并稀释定容至刻度，摇匀，得浓度为0.995 mg/mL的对照品储备液。

1.2.2 供试品溶液的制备 称取松塔粉末1.0 g置于100 mL具塞锥形瓶中，加入0.1 mol/L的HCl 3 mL，20 mL乙酸乙酯，超声温度40℃，超声时间60 min，过滤，减压浓缩，回收乙酸乙酯，残渣用甲醇溶解，置于10 mL容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，备用。

1.2.3 色谱条件 Phenomenex Gemini C18（250× 4.60 mm，5 μm）色谱柱；甲醇-0.1%磷酸水溶液（11∶89，V/V）为流动相；流速1 mL/min；柱温30℃；检测波长298 nm，进样量10 μL。见图1。

图1 云南松松塔样品、原儿茶酸对照品色谱图

1.2.4 标准曲线的绘制 分别精密量取对照品储备液0.1，0.15，0.2，0.3，0.35，0.4 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得梯度对照品溶液，用高效液相色谱仪测定其峰面积，进样量10 μL。以对照品溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归计算，得到回归方程Y=1 110X-43.011，r=0.999 9。测定结果显示，原儿茶酸在9.95～39.80 μg/mL范围内线性关系良好。

后来，我又专门找了张三爷的后辈传人问过，得知他们所练的功夫叫“三皇功”，又叫“内八卦”，但是与八卦掌和三皇炮锤风格迥异，而他也不愿意公开演练，所以张三爷的“三皇功”依然是个谜。

1.2.5 方法学考察 精密度试验结果RSD为0.60%。

称取松塔粉末6份（过60目筛，1.0 g），按照“1.2.2”项方法进行操作，得到重复性试验样品中原儿茶酸的平均含量为131.93 μg/g，RSD为0.65%。

稳定性试验，每隔4 h测定样品液，连续考察24 h，RSD为1.1%。

回收率试验显示，所测样品回收率平均值为99.03%，RSD为0.6%。见表1。

方法学考察结果显示本测定方法精密度、重复性、稳定性、回收率良好，样品液在24 h内基本稳定，该方法适用于云南松松塔中原儿茶酸的提取及含量测定。

表1 加样回收率实验结果

2 云南松松塔中原儿茶酸的提取工艺研究

2.1 工艺筛选 以乙酸乙酯作为提取溶剂，采用L9（34）正交试验设计，对料液比（A）、超声时间（B）、超声温度（C）、HCl浓度（D）的不同水平进行考察，见表2。称取松塔粉末9份（过60目筛，1.0 g），按L9（34）实验安排。见表3。制备样品9份，过滤，减压浓缩，回收乙酸乙酯，残渣用甲醇溶解，置于10 mL容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm滤膜过滤，进样量10 μL，用高效液相色谱仪测定含量并进行方差分析。见表4。

表2 因素水平表

表3 正交试验安排及结果

表4 方差分析

经方差分析可知，各因素对提取效率的影响大小顺序为：A＞B＞C＞D，即料液比为主要影响因素，超声时间次之，其中HCl浓度对结果影响较小。同时，方差分析也表明超声时间与料液比对结果有显著意义。综合分析表明，云南松松塔中原儿茶酸的最佳提取工艺为A3B3C2D1。

2.2 验证试验 按正交试验结果，称取云南松松塔粉末4份（过60目筛，1.0 g）置于100 mL具塞锥形瓶中，精密称定，加入0.1 mol/L的HCl 3mL，40 mL乙酸乙酯，超声温度40℃，超声时间90 min，过滤，减压浓缩，回收乙酸乙酯，残渣用甲醇溶解，置于10 mL容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀。照“1.2.3”项下色谱条件测定并计算含量。见表5。

表5 样品含量测定

3 结论与讨论

3.1 提取溶剂的选择 比较了水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯4种提取溶剂，发现以乙酸乙酯作为提取溶剂，采用加热超声提取的效果最佳，提取效率最高且杂质干扰少〔6〕。同时，确定了云南松松塔中原儿茶酸的最佳提取工艺：以乙酸乙酯为提取溶剂，加入0.1 mol/L的HCl 3 mL，料液比为1∶40（mg/mL），超声时间90 min，超声温度40℃，24 h内基本稳定。

3.2 流动相的选择 文献中〔7-10〕流动相多采用乙腈-冰醋酸、乙腈-甲酸、乙腈-磷酸、乙腈-磷酸二氢铵等系统，但乙腈价格较昂贵，本试验中将流动相优化以甲醇-磷酸（11∶89，V/V），分离效果良好，且价格低廉，实用性强。

优化后的提取工艺简单、稳定、提取率高，该工艺适合工业化生产，为云南松松塔中原儿茶酸的提取提供了依据，所以本实验的研究具有一定的实用意义。

〔1〕严文静，李春艳，杨永寿，等.不同采摘时间云南松松塔中脱氢枞酸的HPLC法测定〔J〕.中国医药工业杂志，2013，44（8）：798-800.

〔2〕施贵荣，李冬梅，杨静，等.思茅松松塔化学成分的初步研究〔J〕.大理学院学报，2013，12（9）：4-6.

〔3〕杨关花，石艳，李智聪，等.原儿茶酸对小鼠黑色素瘤B16细胞酪氨酸酶活力及黑色素生成的抑制效应〔J〕.厦门大学学报，2013，52（6）：842-845.

〔4〕李智勇，夏鹰，陈晓东，等.益智仁提取物原儿茶酸对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用〔J〕.海南医学，2013，24（2）：157-159.

〔5〕李寅珊，李冬梅，蒋凌云，等.云南松松塔的化学成分〔J〕.中国实验方剂学杂志，2012，2（18）：119-121.

〔6〕张丽，冯锋，柳文媛.HPLC法测定不同产地虎耳草中没食子酸、原儿茶酸和虎耳草素的含量〔J〕.西北药学杂志，2011，2（26）：88-90.

〔7〕丁小娟，丁珊珊，吕凌，等.HPLC法同时测定宣木瓜中五种有机酸和原儿茶酸的含量〔J〕.安徽医药，2013，17（9）：1496-1497.

〔8〕刘艳妮，李慧敏，徐融，等.不同产地山茱萸中4种活性成分含量的HPLC分析〔J〕.植物资源与环境学报，2013，22（2）：108-110.

〔9〕黎强，张晓娟，罗玲.高效液相色谱法同时测定盆炎净片中原儿茶酸、咖啡酸和芍药苷含量〔J〕.中国药业，2012， 21（11）：26-27.

〔10〕赵严丽，曾奇风.高效液相色谱法测定田七痛经胶囊中原儿茶酸含量〔J〕.中国药业，2013，22（3）：1-12.

*通信作者：张海珠，讲师.

（责任编辑 李 杨）

Extraction Process of Protocatechuic Acid in the Pinecone of Pinus yunnanensis

WU Daoxun1，2，LIU Lu1，2，WANG Ying1，2，LIU Xi1，2，ZHANG Haizhu1，2*
（1.College of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China；2.Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective：To optimize the extraction process of the pinecone of protocatechuic acid in Pinus yunnanensis.Methods：Different solvents were used to extract protocatechuic acid in Pinus yunnanensis.Their extraction efficiency was taking as index；content was determined by using HPLC chromatography.Finally，L9（34）orthogonal design experiment was used to determine the optimum the extraction process.Results：The optimum extraction process：with ethyl acetate as the extraction solvent，0.1 mol/L HCl 3 mL was added into it.Material-liquid ratio was 1∶40（mg/mL）；ultrasonic time 90 min；ultrasonic temperature 40℃.Conclusion：The Optimized extraction process is simple，stable and have high extraction rate.

Pinus yunnanensis Faranch；pinecone；protocatechuic acid；orthogonal test

R284

A

1672-2345（2014）04-0004-03

10.3969/j.issn.1672-2345.2014.04.002

国家自然科学基金资助项目（81260632）

2014-01-02

2014-03-18

吴道勋，药学专业2010级本科生.