白马雪山牧场中捕食线虫真菌资源调查

苏锡钧，罗宗龙，朱 丹，刘硕然，苏鸿雁

（大理学院农学与生物科学学院，云南大理 671003）

白马雪山牧场中捕食线虫真菌资源调查

苏锡钧，罗宗龙，朱 丹，刘硕然，苏鸿雁*

（大理学院农学与生物科学学院，云南大理 671003）

目的：调查白马雪山牧场中捕食线虫真菌资源及其在不同基质中的分布情况。方法：2012年8月份从白马雪山牧场中采集了97份牦牛粪样，95份土壤样品，进行捕食线虫真菌的分离培养及鉴定。结果：共分离出4属16种捕食线虫真菌，其中1种未定名，Arthrobotrys oligospora和Arthrobotrys thaumasium在土壤样品及牦牛粪便中都出现，频率较高。结论：土壤中的捕食线虫真菌比牦牛粪样中的丰富，具有三维菌网的Arthrobotrys属菌株出现频率较高。

白马雪山；牦牛粪便；捕食线虫真菌；土样；资源

动物寄生线虫对畜牧业养殖危害较大并造成巨大损失〔1〕。长期以来，对家畜线虫病的防治主要是采取合理的放牧管理和以化学药物（如阿苯达唑）防治为主〔2〕。长期使用化学药物会产生以下不良问题，如药物在动物产品肉、蛋、奶中残留、虫体产生抗药性、药物在环境中残留以及药物代谢产物影响生态环境安全等。由于绝大多数化学药物仅对成虫起作用，对虫卵及幼虫无能为力，所以，人们一直在寻找新的防治方法。其中，生物防治最被人们推崇，被认为是最有效和最环保的措施之一。

线虫的天敌——捕食线虫真菌（nematode-trap⁃ping fungi）是目前研发寄生线虫生防制剂的重要资源〔3〕。在新西兰，澳大利亚等畜牧业发达的国家，利用捕食线虫真菌防治动物寄生线虫病取得了一定进展〔4-6〕。如Athrobotrys flagrans已被开发成生防制剂，并成功用于防治家畜寄生线虫〔7-9〕，展示了利用捕食线虫真菌防治家畜寄生线虫的巨大潜力。

牦牛（Bos spp.）是分布于青藏高原其毗邻的高山、亚高山地区的典型高山高寒荒漠动物。本项目对白马雪山牧场牦牛粪便及比邻土壤中捕食线虫真菌资源进行调查，结果将为家畜寄生虫生物防治提供适宜本地生防需要的菌株资源。

1 材料和方法

1.1牦牛粪样及土壤样品采集地点云南省维西塔城白马雪山牧场位于东经98°47′～99°21′，北纬27°25′～28°36′之间，海拔2 200～4 100 m，多为高山寒漠土和亚高山草甸土，属季风气候，干湿季节明显，长冬无夏，春秋短暂。冬半年（11月份到第二年4月份）天气晴朗，日照充足，风速较大，降水少，湿度小，气温日差较大，呈现干季气候特征。而5～10月份，日照少，云量多，降水集中，形成湿季。

1.2采集样品2012年8月15日在白马雪山牧场中随机采集新鲜牦牛粪样品97份，放入无菌封口袋；再以牦牛粪便为中心，20 cm半径的范围内采集土壤样品95份，每份样品约30 g，放入无菌封口袋，带回实验室处理。在室温下，7 d内处理完粪样，20 d内处理完土样。

1.3 CMA的制备称取25 g玉米粉，加水1 000 mL煮沸约30 min，用4层纱布过滤，再向滤液中加入18 g琼脂粉，加水至1 000 mL，混匀，自然pH，分装到500 mL锥形瓶内，在121℃条件下灭菌30 min。

1.4诱饵线虫Panagrellus redivivu的培养和制备

培养：用燕麦片制成的培养基培养诱饵线虫。制备：取少许线虫置于2层擦镜纸上置于漏斗（漏斗通过软管与收集管相接），加适量无菌水，挤压软管排除气泡，静置约1 h，取离心管内的滤出物，加无菌水把线虫浓度稀释到约为2×104～3×104条∕mL。

1.5捕食线虫真菌的分离及捕器诱导

1.5.1 优化诱饵平板法（Baited plates） 用灭过菌的牙签挑取约3 g样品到CMA平板上进行点状洒样，每个样品重复2次，洒样后每皿加入约5 000条线虫做诱饵。为了便于镜检及单孢分离时减少污染，撒样时，距皿边缘l cm左右，样品间留适当空隙。在室温下培养4周后，解剖镜下镜检每个平板，观察捕食线虫真菌。观察到的捕食线虫真菌用无菌方法采用单孢分离技术，在酒精灯下迅速转接到60 mm CMA平板上，在25℃培养箱或室温下培养，培养时间为2～3周。

1.5.2 捕器诱导 在纯培养的CMA平板中央切除1 cm×l cm的培养基，滴加诱饵线虫悬液（约20～100条线虫），25℃温箱培养。对在CMA平板上难于产生捕器的菌株，将其纯培养转接到WA平板上，待平板长满孢子后再接入诱饵线虫。

1.6捕食线虫真菌的鉴定捕食线虫真菌单孢纯化后，用斜插盖玻片法或牙签挖洞法〔10〕观察诱导捕器，在Olympus BX51显微镜下观察形成的各种捕食器类型，确定分生孢子及孢子梗的形态大小、着生方式，测量分生孢子的大小、计算各分隔数占的比例，采用Li Yan等〔11〕分类系统进行鉴定，确定其属、种。

1.7捕食线虫真菌检出率及统计检出率（Occur⁃rence frequency，OF）%=含有某一种物种的样品数∕所有的样品数×l00%。

2 结果

白马雪山牧场中捕食线虫真菌资源调查结果见表1。从表1可知，从97份牦牛粪样中分离出捕食线虫真菌6种，均属Athrobotrys属；从95份土壤样品中分离出捕食线虫真菌14种，分属Athrobotrys、Drechslerella、Dactylellina和Dactylella 4属。从两种样品中共分离到16种（含未知种1种，拟结合现代分子手段进行分类，DNA测序及相关工作正在进行中）捕食线虫真菌，其中Athrobotrys oligospora和Athrobotrys thaumasium在两种样品中均有较高的检出率。此外，土壤中的捕食线虫真菌较牦牛粪样中丰富，Arthrobotrys属的菌株出现频率较高。

表1 白马雪山牧场土壤和牦牛粪样中捕食线虫真菌资源调查结果

3 讨论

白马雪山牧场土壤样品中的捕食线虫真菌检出率明显高于牦牛粪样中的捕食线虫真菌的检出率。这可能是因为牦牛消化道属于厌氧环境，消化道内温度高于外界环境、酸性比土壤强，牦牛进食时随食物所吃进的捕食线虫真菌分生孢子通过消化道后，有部分不能存活，从而使得土壤中捕食线虫真菌检出率比粪便中高。

由于Arthrobotrys属的捕食器为三维菌网，腐生性较强，生长速度较快，所以在白马雪山牧场中土壤样品及牦牛粪便中Arthrobotrys属菌株出现频率较高，为优势菌群，与缪作清等〔12〕、苏鸿雁〔13〕的研究结果一致。

〔1〕蔡进忠.青海省反刍家畜寄生线虫的分类整理〔J〕.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2006，24（S1）:68-72.

〔2〕张德洪，陈亚伟，李明惠，等.阿苯达唑驱虫治疗出现胆道蛔虫症一例报告〔J〕.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1992（4）:306.

〔3〕张克勤，莫明和.中国真菌志，节丛孢及相关属〔M〕.北京:科学出版社，2006：156.

〔4〕LARSEN M，FAEDO M，WALLER P J.The potential of nematophagous fungi to control the free-living stages of nematode parasites of sheep:survey for the presence of fun⁃gi in fresh faeces of grazing livestock in Australia〔J〕.Vet⁃erinary Parasitology，1994，53（3）:275-281.

〔5〕LARSEN M，NANSEN P，WOLSTRUP J，et al.Biological control of trichostrongyles in calves by the fungus Dudding⁃tonia flagrans fed to animals under natural grazing condi⁃tions〔J〕.Veterinary Parasitology，1995，60（3）:321-330.

〔6〕EYSKER M，BAKKER Y，HALL I，et al.The impact of daily Duddingtonia flagrans application to lactating ewes on gastrointestinal nematodes infection in their lambs in the Netherlands〔J〕.Veterinary Parasitology，2006（141）:91-100.

〔7〕WAGHORN T，LEATHWICK D，HEN L，et al.Influence of nematophagous fungi，earthworms and dung burial on de⁃velopment of the free-living stages of Osertagia（Tekadirsa⁃gua）circumcincta in New Zealand〔J〕.Veterinary Parasi⁃tology，2002（104）:119-129.

〔8〕DIMANDER S，HOGLAND J，UGGLA A，et al.Evalua⁃tion of gastro-intestinal nematode parasite control strate⁃gies for first-season grazing cattle in Sweden〔J〕.Veteri⁃nary Parasitology，2003（111）:193-209.

〔9〕TERRIL T，LARSEN M，SAMPLES O，et al.Capbility of the nematode-trapping fungusDuddingtonia flagrans to re⁃duce infective larvae of gastrointestinal nematodes in goat faeces in the southeastern United States:does titration and does titration and does time interval studies〔J〕.Veterinary Parasitology，2004（120）:285-296.

〔10〕苏鸿雁，李明，刘晓轩.捕食线虫真菌玻片制作方法的改进〔J〕.大理学院学报，2006，5（6）:25-26.

〔11〕LI Y，HYDE K，JEEWON R，et al.Phylogenetics and evolution of nematode-trapping fungi（Orbiliales）esti⁃mated from nuclear and protein coding genes〔J〕.Mycolo⁃gia，2005，97（5）:1034-1046.

〔12〕缪作清，刘杏忠.捕食线虫真菌在北京地区果园中的季节性分布〔J〕.菌物系统，2003，22（1）:77-81.

〔13〕苏鸿雁.中甸打日坝牧场捕食线虫真菌资源调查及其季节性分布〔J〕.楚雄师范学院学报，2006，26（1）:54-57.

*通信作者：苏鸿雁，教授.

（责任编辑 毛本勇）

Investigation on the Nematode-trapping Fungi in Baima Snow Mountain

SU Xijun,LUO Zonglong,ZHU Dan,LIU Shuoran,SU Hongyan*
（College of Agriculture and Biology Science,Dali University,Dali,Yunnan 671003,China）

Objective:To investigate the species and distribution of nematode-trapping fungi in Baima Snow Mountain.Methods:97 yak dung and 95 soil samples were taken from Baima Snow Mountain in August 2012 which were followed by isolated culture and identify work in lab.Results:16 species including 1 unnamed species which belongs to 4 categories were isolated from samples. Among the isolated species,Arthrobotrys oligospora and Arthrobotrys thaumasium both were found in soil and yak dung with high occurrence.Conclusion:The species isolated from soil samples were much richer than yak dung.Species with adhesive nets were high frequently found.

Baima Snow Mountain;yak dung;nematode-trapping fungi;soil;resource

Q948：S154.3

A

1672-2345（2014）06-0071-03

10.3969∕j.issn.1672-2345.2014.06.018

国家自然科学基金资助项目（31060019;31100093; 31360013）;云南省教育厅重大专项资助项目（ZD2010010）;云南省中青年学术带头人资助项目（2012HB-042）;云南省高校滇西生物多样性科技创新团队基金资助项目（云教函〔2011〕93号）;大理学院质量工程项目（TDⅠ-05）

2013-09-04

2013-12-30

苏锡钧，实验员，主要从事菌物学研究.