辣椒素对小鼠急性肺损伤氧化应激的影响

南超 韩文文 刘根林 徐丽艳 徐子琴 卢中秋 邱俏檬

【摘要】目的 探讨辣椒素（capsaicin，CAP）对内毒素所致小鼠急性肺损伤中氧化应激的影响。方法 将SPF级ICR小鼠108只随机（随机数字法）分为6组：正常对照组（n=18）、辣椒素对照组（n=18）、抗辣椒素碱（capsazepine，CAPZ）对照组（n=18）、急性肺损伤组（n=18）、CAP干预组（n=18）、CAPZ干预组（n=18），分别于3、8、16 h时点麻醉后活杀，留取肺组织标本。化学比色法检测小鼠肺组织超氧化物歧化酶（supeRoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）活力以及丙二醛（malondiachehyche，MDA）水平；ELISA法检测各组小鼠肺组织血红素氧合酶（heme oxygenase 1，HO-1）水平； RT-PCR及WesteRn blotting检测各组小鼠肺组织NF-E2-相关因子2（NF-E2-Related factoR-2，NRf2）mRNA及其蛋白水平；光镜下观察各组小鼠肺组织病理学改变。多样本间数据比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。结果 与正常对照组相比，急性肺损伤组小鼠SOD、CAT活力明显降低（P<0，05），HO-1水平明显升高，且随着时间变化CAT活力逐渐升高，SOD活力逐渐降低，而HO-1在8 h达峰值，CAP对照组及CAPZ对照组则变化不明显（P>0，05）；与急性肺损伤组相比，CAP干预组CAT、SOD活力及HO-1水平在8 h、16 h明显升高（P<0，05），CAPZ干预组SOD活力及HO-1水平则在8 h、16 h明显降低（P<0，05），CAT在16 h明显降低（P<0，05）。与正常对照组相比，急性肺损伤组小鼠MDA水平明显升高（P<0，05），CAP对照组及CAPZ对照组则变化不明显（P>0，05）；与急性肺损伤组相比，CAP干预组小鼠MDA水平在3、8、16 h明显降低（P<0，05），CAPZ干预组MDA含量则在3、8、16 h明显升高（P<0，05）。急性肺损伤组小鼠肺组织在3、8、16 h NRf2蛋白和NRf2mRNA水平明显高于正常对照组（P<0，05），CAP对照组和CAPZ对照组则无明显变化（P>0，05）；与急性肺损伤组相比，CAP干预组小鼠肺组织在8 h、16 h NRf2蛋白及mRNA水平明显升高（P<0，05），CAPZ干预组小鼠肺组织在8 h、16 h NRf2蛋白及mRNA水平则明显降低（P<0，05）。光镜下，CAP对照组及CAPZ对照组小鼠肺损伤程度与正常对照组相比无明显差别，急性肺损伤组8 h、16 h较正常对照组肺组织损伤明显，CAP干预组肺损伤程度较急性肺损伤组轻，CAPZ干预组较急性肺损伤组重。结论 氧化应激是内毒素血症小鼠急性肺损伤发生的重要环节，CAP激活TRPV1能够上调NRf2的水平和二相解毒酶的活性，从而减轻急性肺损伤小鼠氧化应激损伤。

【关键词】辣椒素受体感受器电位香草酸受体1；急性肺损伤；血红素氧合酶；核因子E2相关因子2转录因子

Effects of capsaicin on oxidative stRess in lipopolysacchaRide-induced acute lung injuRy in mice Nan Chao， Han Wenwen， Liu Genlin， Xu Liyan， Xu Ziqin， Lu Zhongqiu， Qiu Qiaomeng. EmeRgency DepaRtment of the FiRst Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou 325000， China

CoRResponding authoR： Qiu Qiaomeng， Emial：qqm@hosp1，ac，cn

【AbstRact】Objective To investigate the effects of tRansient ReceptoR potential vanilloid 1 activation by capsaicin on the oxidative stRess in lipopolysacchaRide-induced lung injuRy in mice in oRdeR to elucidate the potential mechanisms. Methods A total of 108 specific pathogen fRee （SPF） ICR male mice weRe Randomly divided into six gRoups： noRmal contRol gRoup （n=18）， capsaicin contRol gRoup （CAP contRol gRoup， n=18）， capsazepine contRol gRoup （CAPZ contRol gRoup， n=18）， acute lung injuRy gRoup （n=18）， capsaicin tReatment gRoup （CAP tReatment gRoup， n=18） and capsazepine tReatment gRoup （CAPZ tReatment gRoup， n=18）. AfteR modeling， supeRoxide dismutase （SOD）， catalase （CAT） and malondiachehyche （MDA） levels in lung weRe measuRed with the method of chRomatometRy， and the expRession of heme oxygenase 1（HO-1） in lung tissue was assessed with enzyme linked immunosoRbent assay （ELISA）， while the level of NF-E2-Related factoR-2（NRf2）was deteRmined by westeRn blotting and the expRession of NRf2 mRNA was measuRed by RT-PCR. Pathological changes of lung tissue weRe obseRved undeR light micRoscope. Results The activities of SOD and CAT in lung tissue at 3， 8， 16 h weRe dRamatically loweR in acute lung injuRy gRoup than those in noRmal contRol gRoup （P<0，05）， while the level of MDA was higheR. CompaRed with acute lung injuRy gRoup， the lung levels of SOD and CAT at 8 h and 16 h weRe higheR in CAP tReatment gRoup （P<0，05）， while the lung level of MDA was loweR （P<0，05）. The levels of SOD and CAT in CAPZ tReatment gRoup weRe decReased at 8 h and 16 h， while the levels of MDA in this gRoup weRe incReased at 3， 8， 16 h （P<0，05）. The pulmonaRy levels of HO-1， NRf2 and expRession of NRf2 mRNA weRe significantly higheR in acute lung injuRy gRoup than those in noRmal contRol gRoup （P<0，05）. CompaRed with acute lung injuRy gRoup， the levels of HO-1， NRF2 and expRession of NRF2 mRNA weRe incReased maRkedly in CAP tReatment gRoup （P<0，05） and weRe obviously decReased in CAPZ tReatment gRoup （P<0，05）. At 8 h， 16 h afteR modeling， the degRee of lung damage was amelioRated in CAP tReatment gRoup compaRed with acute lung injuRy gRoup undeR light micRoscope， while the lung damage was aggRavated in CAPZ tReatment gRoup.Conclusions The activation of TRPV1 could appaRently up-Regulate the levels of CAT， SOD， NRf2， HO-1， and Reduce the MDA level in lung tissue of mice with acute lung injuRy， ultimately pRotecting the endotoxemia mice fRom oxidative stRess.

【Key woRds】TRansient ReceptoR potential vanilloid 1； Acute lung injuRy ； Heme oxygenase 1； NucleaR factoR E2-Related factoR-2

内毒素血症是急性肺损伤发生的常见病因。研究证实，内毒素能够诱导肺组织氧自由基的大量产生，导致细胞通透性增加、细胞水肿和坏死，目前尚无有效的治疗措施。辣椒素受体感受器电位香草酸受体1（tRansient ReceptoR potential vanilloid 1，TRPV1）是一种非选择性阳离子通道，在炎症和疼痛等病理生理学过程中具有一定的作用。研究发现，激活TRPV1能够有效降低脓毒症大鼠血清丙二醛（malondiachehyche，MDA）和氮氧化物水平[1]，但其机制及其与急性肺损伤发生的关系尚不明确。核因子E2相关因子2转录因子（nucleaR factoR E2-Related factoR-2，NRf2）属于Cap 'n' CollaR家族，能够启动下游的II相解毒酶、抗氧化蛋白等基因转录和表达，从而增加细胞对氧化损伤的抗性。有鉴于此，本实验采用腹腔注射内毒素方法制造ICR小鼠急性肺损伤模型，用辣椒素和抗辣椒素碱激活和拮抗TRPV1，从正反两方面观察NRf2及其下游抗氧化物的活力改变，探讨TRPV1的变化对内毒素所致急性肺损伤小鼠氧化应激的影响和机制。

1 材料与方法

1，1 材料

1，1，1 试剂 LPS、辣椒素（capsaicin，CAP）、抗辣椒素碱（capsazepine，CAPZ）购自美国sigma公司；过氧化氢酶（catalase， CAT）、超氧化物歧化酶（supeRoxide dismutase， SOD） 、丙二醛（Malondiachehyche， MDA）试剂盒购自南京建成生物工程研究所，抗小鼠NRf2一抗购自英国abcam公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）购自美国milipoRe公司；核蛋白提取试剂盒购自中国碧云天生物技术研究所；BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）购自中国碧云天生物技术研究所；血红素氧合酶（heme oxygenase 1，HO-1）ELISA试剂盒购自美国R&D; Systems公司；TRizol购自美国InvitRogen公司；PCR引物购自上海基康生物工程公司；Tap PCR masteR mix试剂盒购自北京天根生化科技公司；逆转录-PCR试剂盒购自美国theRmo scientific公司。

1，1，2 动物 SPF级ICR小鼠108只，雄性，体质量18～22 g，由温州医学院动物中心提供。

1，2 方法

1，2，1 动物实验 将小鼠随机（随机数字法）分为6组：健康对照组（n=18），CAP对照组（n=18），CAPZ对照组（n=18），急性肺损伤组（n=18），CAP干预组（n=18），CAPZ干预组（n=18）。健康对照组：小鼠腹腔注射生理盐水，3、8、16 h时点麻醉活杀；CAP、CAPZ对照组：先分别给两组小鼠皮下注射CAP（1 mg/kg）、CAPZ（15 mg/kg），30 min后腹腔注射生理盐水，分别于3、8、16 h时点麻醉活杀；急性肺损伤组：给小鼠腹腔注射LPS 10 mg/kg，构建急性肺损伤模型，分别于3 h、8 h、16 h麻醉活杀；CAP、CAPZ干預组：先分别给两组小鼠皮下注射CAP（1 mg/kg）、CAPZ（15 mg/kg），30 min后腹腔注射LPS 10 mg/mL，分别于3、8、16 h麻醉活杀。以上各组活杀后取肺组织，-70 ℃保存。

1，2，2 比色法 取10 %肺组织匀浆，用BCA法测定蛋白含量，采用比色检测肺组织CAT、SOD、MDA水平，严格按照试剂盒说明书操作。

1，2，3 ELISA法 取10%肺组织匀浆，用BCA法测定其蛋白含量，采用ELISA法检测肺组织HO-1水平，按照试剂盒说明书操作，将检测值后除以相应各样本蛋白浓度值，计算HO-1表达相对水平。

1，2，4 RT-PCR 按试剂盒说明书要求，提取小鼠肺组织细胞总RNA，检测浓度及纯度，进行逆转录、扩增。NRf2基因引物序列上游GGACCTAAAG

CACAGCCAACAC，下游TCCCTCTCCTGCGTATAT

CT，55 ℃退火，循环35次，产物长度356 bp；β-actin上游AGAGGGAAATCGTGCGTGAC，下游GAGGTCTTTACGGATGTCAACG，产物长度266 bp。产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，采用凝胶成像分析系统观察电泳结果，用Quantity One 软件进行灰度值分析，计算目的基因/β-actin，计算该基因表达相对值。

1，2，5 WesteRn blotting 按照试剂盒说明书提取肺组织核蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取40 μg蛋白上样，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜60 min，封闭60 min，一抗按1∶ 1000稀释，过夜孵育，二抗1∶ 5000稀释，孵育1 h，ECL显影，曝光。采用Quantity one进行灰度分析，目的蛋白与内参灰度比值即此目的蛋白的相对含量。

1，2，6 病理学观察 将肺组织于4%甲醛中固定，石蜡包埋，进行切片和HE染色，光镜下观察病理学改变。

1，3 统计学方法

采用SPSS 19，0软件进行统计学处理，数据以均数±标准差（x±s）表示。多样本间数据比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，若方差不齐则进行秩和检验，以P<0，05为差异具有统计学意义。

2 结果

2，1 急性肺损伤组小鼠肺组织SOD、CAT及MDA水平变化及CAP、CAPZ的影响

与健康对照组相比，急性肺损伤组小鼠肺组织SOD、CAT活力明显降低（P<0，05），且随着时间变化CAT活力逐渐升高，SOD活力逐渐降低，CAP对照组及CAPZ对照组变化不明显（P>0，05）；与急性肺损伤组相比，CAP干预组CAT、SOD活力在8 h、16 h明显升高（P<0，05），CAPZ干预组SOD活力在8、16 h明显降低（P<0，05），而CAT在16 h明显降低（P<0，05） （表1、表2） 。

与健康对照组相比，急性肺损伤组小鼠肺组织MDA水平明显升高（P<0，05），CAP对照组及CAPZ对照组则变化不明显（P>0，05）；与急性肺损伤组相比，CAP干预组小鼠肺组织MDA水平在3、8、16 h明显降低（P<0，05），CAPZ干预组MDA含量则在3、8、16 h明显升高（P<0，05）（表3）。

2，2 急性肺损伤组小鼠肺组织HO-1水平变化及CAP、CAPZ的影响

与健康对照组相比，急性肺损伤组HO-1水平在各时间点明显升高（P<0，05），于8 h点达峰值，CAP对照组、CAPZ对照组与正常对照组比较差异无统计学意义（P>0，05）；与急性肺损伤组比较，CAP干预组HO-1水平在8 h、16 h明显升高（P<0，05），3 h升高不明显（P>0，05），CAPZ干预组HO-1水平在8 h、16 h明显低于急性肺损伤组（P<0，05），3 h降低不明显（P>0，05）。见表4。

2，3 急性肺损伤组小鼠肺组织NRf2 mRNA

表达量变化及CAP、CAPZ的影响

与健康对照组比较，急性肺损伤组NRf2 mRNA水平在各时间点明显升高（P<0，05），于8 h点达峰值，CAP对照组、CAPZ对照组与健康对照组比较差异无统计学意义（P>0，05）；与急性肺损伤组比较，CAP干预组NRf2 mRNA水平在8 h、16 h明显升高（P<0，05），3 h升高不明显（P>0，05），CAPZ干预组NRf2 mRNA水平在8 h、16 h明显低于急性肺损伤组（P<0，05），3 h降低不明显（P>0，05）（图1、表5）。

A：3 h各组小鼠肺组织NRf2mRNA变化；B：8 h各组小鼠肺组织NRf2mRNA变化；C：16 h各组小鼠肺组织NRf2mRNA变化；1：健康对照组，2：CAP干预组，3：CAPZ干预组，4：急性肺损伤组，5：CAP干预组，6：CAPZ干预组

2，4 急性肺损伤组小鼠肺组织NRf2蛋白表达量变化及CAP、CAPZ的影响

与同时间点健康对照组比较，急性肺损伤组NRf2蛋白水平在各时间点明显升高（P<0，05），于8 h点达峰值，CAP对照组、CAPZ对照组与健康对照组比较差异无统计学意义（P>0，05）；与急性肺损伤组比较，CAP干预组NRf2蛋白水平在8 h、16 h明显升高（P<0，05），3 h升高不明显（P>0，05），CAPZ干预组NRf2蛋白水平在8 h、16 h明显低于急性肺损伤组（P<0，05），3 h降低不明显（P>0，05）。见图2。

A：3 h各组小鼠肺组织NRf2蛋白表达量变化；B：8 h各组小鼠肺组织NRf2蛋白表达量变化；C：16 h各组小鼠肺组织NRf2蛋白表达量变化；1：健康对照组，2：CAP干预组，3：CAPZ干预组，4：急性肺损伤组，5：CAP干预组，6：CAPZ干预组

2，5 各组小鼠肺组织病理学改变

光镜下，健康对照组、CAP对照组以及CAPZ对照组肺组织结构清晰，肺泡腔内无炎性细胞浸润，无出血，肺间质无明显渗出；急性肺损伤组3 h损伤不明显，但8 h、16 h可见肺泡腔大小不等，部分肺泡壁断裂呈气肿状，部分增宽，肺泡毛细血管扩张，部分肺泡内可见出血，肺间质水肿，可见炎症细胞浸润；与急性肺损伤组相比，CAP干预组肺泡壁增厚、毛细血管扩张、炎细胞浸润及肺间质水肿程度明显减轻；CAPZ干预组无明显加重。见图3。

3 讨论

虽然导致ALI/ARDS的致病因素存在差异，但各种细胞通过呼吸爆发产生大量活性氧引起氧化应激，导致机体氧化/抗氧化失衡，在其中具有重要作用。研究发现， 胞外SOD缺乏的失血性休克小鼠更易发生急性肺损伤，其肺內中性粒细胞和MPO活性也增加[2]，而肺组织胞外SOD过表达的失血性休克小鼠则肺损伤减轻[3]。CAT可催化胞内过氧化氢分解为O2和H₂O，从而使细胞免受过氧化氢的损害。另外MDA是细胞脂质过氧化的产物，其大小可间接反映细胞氧化损伤的程度，在临床上血MDA水平有助于判断脓毒症患者预后情况。研究表明，脓毒症小鼠肺内CAT、SOD水平显著降低，MDA水平升高，氧化应激水平较高[4]，这一现象在H2S中毒大鼠肺损伤模型中也得到了验证[5]。本实验中内毒素诱导的急性肺损伤小鼠肺组织SOD和CAT在早期即有降低，而MDA水平则明显升高，提示氧化应激在内毒素血症小鼠急性肺损伤中发挥着重要作用。

NRf2是细胞氧化应激过程中的关键调节因子，在炎症或氧化应激状态下，NRf2可与其抑制剂Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Keap1）解离，移位至核内，与“抗氧化反应元件”结合，转录下游目的基因[6]。已有研究证实，NRf2基因敲除的脓毒症小鼠死亡率升高，器官损伤程度以及循环中炎症因子的水平也较野生型升高[7]。此外，NRf2基因敲除后小鼠HO-1、NQO-1等产生减少，且较野生型小鼠更易受氧化剂损伤[8]，从基因敲除小鼠分离出的巨噬细胞也更易受氧化剂损伤[9]。HO-1是NRf2下游调节因子，其代谢产物CO和胆红素均有细胞保护作用[10-11]。MoRse等[12]报道，内毒素所致脓毒症小鼠吸入CO后，其血清IL-6和IL-1β水平降低，死亡率也显著降低。也有实验证实，HO-1的mRNA表达上调可减轻肢体缺血-再灌注损伤后心肌的氧化损伤[13]。本实验中，内毒素血症组小鼠肺NRf2早期升高，并与HO-1、SOD、CAT等表达密切相关，提示NRf2在急性肺损伤氧化应激中发挥着重要的作用。但是NRf2早期升高后迅速下降，肺损伤加重，机体氧化/抗氧化明显失衡，因此上调NRf2水平可能是减轻氧化应激，治疗急性肺损伤的有效措施。

TRPV1是一非选择性阳离子电压门控通道，主要定位于分泌P物质和降钙素基因相关肽的传入感觉神经纤维C和Aδ上[14-15]，主要感受伤害性刺激和有害热，受体激动剂是辣椒素，抑制剂是抗辣椒素碱。TRPV1最初被研究者认识是在有人用克隆筛选技术从大鼠背根神经节神经元中将其克隆出来开始的[16]，但是在此之前，早已有人用其激动剂辣椒素进行过一系列研究，并且发现辣椒素预处理可以抑制化学刺激物如氯仿、四氯化碳、二氯钾等所引起的脂质过氧化变化[17]。Chen等[18]发现，辣椒素可抑制巨噬细胞中LPS所致一氧化氮合酶以及COX-2基因的产生。此外，辣椒素3 μg/mL还可以保护红细胞免受t-BHP所致的氧化应激损害[19]。DemiRbilek等[1]采用不同剂量辣椒素干预脓毒症大鼠，发现小剂量辣椒素可以抑制大鼠血清NOx以及MDA水平，但具体机制不明。本实验中CAP干预组抗氧化物SOD和CAT水平较急性肺损伤组显著升高，而CAPZ干预组显著降低，这说明用辣椒素激活TRPV1受体可以起到抗氧化作用。更为重要的是，CAP干预组NRf2和HO-1较急性肺损伤组也显著升高，而CAPZ干预组NRf2和HO-1则较急性肺损伤组显著降低，提示TRPV1受体对机体氧化应激的影响可能与其对NRf2的调节有关。

综上所述，TRPV1激活后可以有效抑制内毒素血症小鼠急性肺损伤的发生，其机制可能是通过调节NRf2及其下游的抗氧化分子来实现的，从而为急性肺损伤的治疗提供了新的靶点和理论依据。

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（收稿日期：2013-06-07）

（本文编辑：邵菊芳）

DOI：10，3760/cma，j，issn，1671-0282，2014，01，013

基金项目：浙江省“十二五”重点学科建设计划资助；浙江省医学创新学科（11-CX26）；浙江省中医药重点学科（2012-XK-A28）；温州市高层次人才创新技术重点资助项目

作者单位：325000 浙江省温州，温州医科大学附属第一医院急诊医学中心（南超、韩文文、刘根林、徐丽艳、邱俏檬、卢中秋）；温州市人民医院ICU（徐子琴）

通信作者：邱俏檬， Email：qqm@hosp1，ac，cn

P50-55