益母草注射液有效部位提取及其对凝血系统的影响研究❋

赵小梅，彭 成 ,熊 亮，谢晓芳

(成都中医药大学药学院，成都 610075)

近年来，文献频频报道益母草注射液在临床上预防产后出血疗效显著，但益母草属于传统中药学的活血化瘀类药。现代药理研究亦表明，其具有活血的作用，包括抗血小板聚集、抗凝、纤溶等活性[1～4]。益母草注射液作为具有代表性意义的成药，用于产后出血主要取其具有收缩子宫的功效，但对其活血化瘀有效物质基础以及活血而不加重产后出血的作用机制尚无深入研究。因此，作者通过提取分离益母草注射液有效部位，深入探索其对凝血系统的影响及其作用机制，为益母草注射液二次开发或指导临床安全用药提供科学的参考依据。

1 材料

1.1 动物

10只健康雌性SD大鼠，体质量200±20 g，由成都中医药大学动物实验中心提供(质量合格证号SCXK(川)2008-11)。6只健康雄性SD大鼠，体质量200±20 g，由成都中医药大学动物实验中心提供(质量合格证号SCXK(川)2008-11)。

1.2 药物

阿司匹林肠溶片由辰欣药业股份有限公司生产(批号120529210)。

1.3 试剂

凝血酶原时间(PT，批号545487)、活化部分凝血活酶时间(APTT，批号547163A)、纤维蛋白原(FIB，批号538043)及凝血酶时间(TT，批号42282)测定试剂均购自德国SIEMENS公司。腺苷二磷酸(ADP，批号SLBB1854)、纤维蛋白原(Fibrinogen,批号F8630)、凝血酶(Thrombin, 批号T4648)均由美国Sigma公司生产。琼脂粉(Agar，JAPAN进口分装，分装号89054120，购自溶海生物技术(成都)有限公司)，PBS磷酸盐缓冲液粉末(批号20130311，北京中杉金桥生物科技有限公司)。

1.4 仪器

日本SYSMEX株式会社CA-500型血凝仪，SC-2000血小板聚集测试仪，德国Heraeus台式离心机Biofuge Stratos，Sanyo CO2培养箱MLO-15A。

2 方法

2.1 益母草注射液有效部位的制备

益母草注射液浸膏(1200 g)经水分散溶解，上样于D101型大孔吸附树脂，以水-乙醇梯度洗脱，回收溶剂得水及15%、30%、45%、60%、95%乙醇洗脱部分。水洗脱部分(550 g)上样于732型强酸型离子交换树脂，以水及3 mol/L的NaCl溶液洗脱。水洗脱部分回收溶剂得非生物碱部分(300 g)。NaCl溶液洗脱液用NaOH调pH至6-7，回收溶剂，所得固形物加甲醇超声提取过滤，残渣重复处理3次，合并滤液并回收溶剂得生物碱部分(220 g)。上述非生物碱部分、生物碱部分采用去离子水稀释备用。

2.2 样本采集与测定方法

2.2.1 体外凝血4项值的测定 取雌性SD大鼠10只，采用20%乌拉坦麻醉，经股静脉取血，每只3.6 ml，以3.8%枸橼酸三钠1∶9抗凝，经3500 r离心10 min，可获得2 mL左右血浆。取200 μL×7份，可平行进行7组实验：阴性对照组、益母草注射液水溶性非生物碱部分高、中、低剂量组和益母草注射液水溶性生物碱部分高、中、低剂量组，于实验前分别加入20 μL相应药物，其中阴性对照组加入生理盐水，实验组分别加入不同剂量的实验药物。经充分混匀，37 ℃温浴5 min。以全自动血凝仪测定各组凝血4项指标值，每组重复10次。

2.2.2 体外血小板聚集率的测定 取雄性SD大鼠6只，采用20%乌拉坦麻醉，经股静脉采血每只取血3.6 mL，3.8%枸橼酸三钠1∶9抗凝，25 ℃离心200 g×10 min，取上液作为PRP，剩余部分继续离心2200 g×10 min作为PPP，采用同只鼠的PPP稀释PRP至2.5～3.5×108/mL，每只鼠的PRP可平均分成300 μL×8份，平行进行8组实验，即阴性对照组、阳性对照组、益母草注射液水溶性非生物碱部分高、中、低剂量组和益母草注射液水溶性生物碱部分高、中、低剂量组。应用SC-2000四通道血小板聚集仪，按Born比浊法[5]测定血小板聚集性。用PPP调零，取300 μl PRP分别加入20 μL相应药物，37 ℃温浴5 min，然后加入5 μmol ADP，每次测试时间为5 min，记录最大聚集率，计算血小板聚集抑制率=(对照管血小板最大聚集率-给药管血小板最大聚集率)/对照管血小板最大聚集率×100%，每组重复6次。

2.2.3 体外纤维平板实验 参照文献方法[6]，用PBS缓冲液配制10 mg/mL纤维蛋白原溶液、1 U/mL凝血酶和100 U/mL尿激酶。取0.2 g琼脂粉加20 mLPBS缓冲液加热溶解，待温度降至55～60 ℃时，取18 mL放入玻璃杯中，加入30 ℃的纤维蛋白原溶液1 mL，摇匀后再加入30 ℃的凝血酶溶液1 mL，摇匀后立即放入水平放置的90 mm玻璃培养皿中，待冷凝后采用7 mm中空打孔器打孔。在孔中加入相应药物50 μl，其中阴性对照组加入生理盐水，阳性对照组加入尿激酶，实验组分别加入不同剂量的益母草注射液水溶性非生物碱和益母草注射液水溶性生物碱。然后将平板放入37 ℃的培养箱，16 h后测定结果，每组重复6次。

3 结果

3.1 益母草注射液两大部分体外给药对凝血4项指标的影响(表1)

表1 益母草注射液有效部位体外给药对凝血四项的影响

注：n代表样本量，与阴性对照组比较：△P<0.05，*P<0.01

益母草注射液水溶性非生物碱部分能明显延长PT和APTT，其水溶性生物碱部分能明显缩短APTT，两者均能明显降低血纤维蛋白原含量和延长TT。

3.2 体外血小板聚集实验的测定结果

表2显示，益母草注射液两大部分均具有明显的抗ADP诱导血小板聚集作用，尤以益母草注射液水溶性非生物碱部分的抗血小板聚集作用更强。

3.3 体外纤维平板实验测定结果

表3显示，益母草注射液水溶性非生物碱部分具有明显的纤溶活性，且呈明显的量效关系，益母草注射液水溶性生物碱部分未见明显的纤溶活性。

表2 益母草注射液有效部位体外给药对ADP诱导血小板聚集的影响

注：与阴性对照组比较：△P<0.05，*P<0.01(n代表样本量)

表3 益母草注射液有效部位体外给药对纤维蛋白的溶解作用

注：n代表样本量

4 讨论

近年来，随着人们对妊娠机体生理变化认识的逐渐深入，研究发现在妊娠过程中孕妇表现为凝血功能逐渐增强、纤溶功能逐渐减弱的生理变化，血液呈现高凝状态，这样一种生理变化能为产后快速有效地止血提供物质基础，但部分妇女可能出现病理状态。病理性高凝状态极易诱发DIC和血栓性疾病[7，8]，如妊娠期易栓症及分娩后发生血栓的风险极度升高。因此，对于易栓症患者在治疗原发症的同时，抗凝治疗起着不可替代的作用[9，10]。但目前临床上最常用的肝素易诱发严重出血，而对于易栓症患者抗凝治疗应以产时不引起过度失血为目的[11]，因此迫切需要找到新型抗凝药物。

本研究中发现，益母草注射液同时具有活血与止血作用，止血作用机制与缩短内源性凝血时间有关，活血作用机制与延长内外源性凝血时间、抗血小板聚集和纤溶有关。目前的临床报道表明，益母草注射液产后给药并不增加产后出血量[12]，这种天然的配伍形式比较适合临床预防产妇血栓性疾病和DIC发生。如能更好地协调两大部分的配比，可为产科抗凝治疗开辟新的局面。该提取分离方法对益母草注射液二次开发具有重要意义。

此外，本研究结果中，益母草注射液水溶性非生物碱部分和生物碱部分都能明显降低血纤维蛋白原含量，但在纤维平板实验中后者却未见明显的纤溶活性，表明前者对已形成的纤维蛋白仍存在降解作用，而后者却仅对纤维蛋白未形成前有作用，具体机制有待进一步研究。

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