温度和接种量对搅打奶油中金黄色葡萄球菌生长及产肠毒素的影响

王 彤，林 露，严维凌,*，欧 杰，陈 敏

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.上海市食品研究所，上海 200235；3.上海市疾病预防控制中心，上海 200336）

温度和接种量对搅打奶油中金黄色葡萄球菌生长及产肠毒素的影响

王 彤1，林 露2，严维凌2,*，欧 杰1，陈 敏3

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.上海市食品研究所，上海 200235；3.上海市疾病预防控制中心，上海 200336）

目的：研究金黄色葡萄球菌在搅打奶油中的生长以及产毒特性。方法：将不同浓度的初始接种量的产A型肠毒素金黄色葡萄球菌菌液接种到奶油中并搅打成型，低接种量控制在2～3（lg（CFU/g）），高接种量控制在4（lg（CFU/g））以上。定时测量不同贮存温度条件下奶油中的金黄色葡萄球菌的菌落总数以及产毒状况。结果：36 ℃条件下生长速率最快，其他温度条件下依次降低；低初接种量水平下，只有36 ℃条件下于27 h检测到产生毒素，其他温度条件下未检测到毒素产生；高初接种量水平条件下，在36 ℃于12 h、25 ℃于24 h、15 ℃于66 h检测到产生毒素，5 ℃条件下金黄色葡萄球菌既不生长，又不产毒。结论：随着温度的升高，金黄色葡萄球菌的生长速率随之升高，产肠毒素的时间也随之缩短，高初始接种量水平肠毒素产生的时间短于低初始接种量水平，肠毒素的产生时间为一般在对数期的中后期，此时金黄色葡萄球菌菌落总数≥6（lg（CFU/g））。

金黄色葡萄球菌；肠毒素；搅打奶油

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种人畜共患病的重要致病菌。据美国疾病控制与预防中心报告，金黄色葡萄球菌索引引发的食物中毒事件位居第二位，仅次于大肠埃希菌，占细菌引起的食物中毒的33%。在加拿大发生的概率更高，占45%。我国每年亦发生此类中毒事件，各地均有报道。金黄色葡萄球菌能够产生一系列的致病物质如毒素、酶类和菌体的一些成分，其中肠毒素（Staphylococcus aureus enterotoxins，简称SEs）在该菌的致病性中起着重要的作用[1-13]。

搅打奶油又称稀奶油，乳脂含量35%左右，经搅打打发后体积可增加数倍，从流动状变为非流动状并具有可塑性，是制作裱花蛋糕、夹芯蛋糕、泡芙、提拉米苏等西式烘焙食品的重要原料。商品化的搅打奶油都经过超高温瞬时灭菌（ultra high temperature treated，UHT）灭菌和无菌灌装，不含致病菌，但一旦打开包装，其后的加工贮藏环节包括搅打、裱花等都涉及到大量的人工操作，并且长时间暴露在空气中，而金黄色葡萄球菌作为自然界中常见的微生物，在30%～50%健康成年人的皮肤、黏膜表面及鼻咽部以及空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到，加上乳和乳制品是金黄色葡萄球菌的主要宿主，因此对于制作蛋糕等烘焙食品的面包房，一旦由于卫生消毒措施的不到位，有可能造成金黄色葡萄球菌污染加工好的食品并导致食物中毒[14]。

对于食品中金黄色葡萄球菌的生长规律及其产肠毒素条件的研究，是开展风险评估、食品安全标准制定、产品生产卫生操作规范形成的重要技术依据和支撑。从理论上讲，金黄色葡萄球菌的生长规律及其产肠毒素的条件已非常清楚，但这都是基于培养基的理想状态下获得的数据。由于细菌作为原核生物，营养状况、环境因素对其生长和基因的表达起着十分重要的作用[15]。不同的食品由于其营养成分的构成、贮存条件的差异等，金黄色葡萄球菌在不同食品中的生长规律及其产肠毒素的条件也完全不同，因此国内外已有科学家对各种食品中的金葡菌生长产毒规律进行了研究，例如王小红等[16]研究了原料奶接种金葡菌后在酸奶发酵中是否产毒素的可能性，王定德等[17]研究了金葡菌在蘑菇罐头中的生长产毒素规律；Nipa等[18]研究了一种猪肉发酵肉制品中金黄色葡萄球菌产肠毒素的风险；Notermans等[19]则研究在在肉类以及蔬菜中金黄色葡萄球菌的生长以及产毒规律；Doan等[20]将金葡菌株接种到油炸鲜切脱皮土豆条中，在26.7 ℃贮藏，经过5 h可以检测出肠毒素，因此认为薯条发生金黄色葡萄球菌食物中毒的风险非常高。但目前国外内对于金黄色葡萄球菌在搅打奶油中生长及产肠毒素的规律尚无相关的研究报道。

虽然金黄色葡萄球菌普遍存在于环境、人体和生鲜食品中，但并非所有菌株都产肠毒素。为使本实验的研究结论具有通用性和普遍性，本实验选择了一株产最常见、毒力最强的肠毒素A的金黄色葡萄球菌菌株作为研究对象，将其培养、接种到搅打奶油中，研究其生长和产肠毒素的规律。为奶油的安全贮存和安全风险评估提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

产A型肠毒素的金黄色葡萄球菌（SA14966） 上海市食品研究所保存；1 L装安佳淡奶油 市购；营养肉汤、营养琼脂 上海疾控华康科技开发公司；Baird-Parker琼脂基础、亚碲酸盐卵黄增菌液、BHI肉汤 北京陆桥技术责任有限公司；Tecra™微孔板法葡萄球菌肠毒素A-E快速检测试剂盒、Petrifilm™金黄色葡萄球菌测试片 美国3M公司。

1.2 仪器与设备

BSC-1000-Ⅱ-A2生物安全柜、THZ-8AA气溶恒温振荡器 金坛市城西天竟实验仪器厂；冰箱、电热恒温培养箱 上海医疗机械七厂；隔水式恒温培养箱、霉菌培养箱 上海一恒科技有限公司；H2050R台式高速冷冻离心机 长沙湘仪离心器仪器有限公司；酶标仪 热电（上海）机械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种的活化

将冻藏的菌液解冻，用移液管吸取1 mL菌液加入50 mL已经灭菌的营养肉汤中，置于37 ℃、100 r/min摇床振荡培养18～20 h，之后进行平板划线分离置于37 ℃培养箱中培养24 h，得到单菌落。

1.3.2 菌液的制备与除毒

根据Peter等[21]的方法并进行修改，于超净台内挑取一环接种于灭菌的LB肉汤中，于37 ℃、100 r/min摇床培养18～20 h；吸出50 mL菌液于4 ℃、10 000 r/min离心20 min；弃去上清液后，细胞沉淀加入用冷的50 mL灭菌的0.1 mol/L磷酸钾缓冲液（K2HPO4-KH2PO4，pH 7）混匀；于4 ℃、10 000 r/min离心20 min；弃去上清液；再将细胞沉淀加入用冷的50 mL灭菌的0.1 mol/L磷酸钾缓冲液（K2HPO4-KH2PO4，pH 7）混匀；于4 ℃、10 000 r/min离心20 min；弃去上清液，再将细胞沉淀加入50 mL灭菌的0.1 mol/L磷酸钾缓冲液（K2HPO4-KH2PO4，pH 7）混匀，得到菌种原液。以上2 次冲洗的目的是保证制得菌种原液只含有金黄色葡萄球菌的细胞，而没有金黄色葡萄球菌的肠毒素。

1.3.3 不同实验温度和接种量的设计

为了模拟搅打奶油中金黄色葡萄球菌的不同污染程度，初始菌种量分别设置为高接种量和低接种量，低接种量控制在2～3（lg（CFU/g）），高接种量控制在4（lg（CFU/g））以上。

将菌液接入到1 L淡奶油中进行搅拌打发均匀，为了了解在不同贮存温度条件下金黄色葡萄球菌的生长和产肠毒素规律，本实验分别设置（5±1）、（15±1）、（25±1）、（36±1）℃作为搅打奶油的贮存温度。其中（5±1）℃的环境条件下菌落总数每隔12 h进行一次计数，共计13 次；（15±1）℃环境条件下每隔6 h计数一次，共计13 次；（25±1）℃环境条件下每隔4 h进行一次计数，共计13 次；（35±1）℃每隔3 h进行一次计数，共计13 次。每次计数称取10 g样品至盛有90 mL 0.9%灭菌的生理盐水中，每次计数测量2 个平行样。采用Petrifilm™金黄色葡萄球菌测试片进行计数[22]。同时，另取20 g左右样品留样用来测定肠毒素。

1.3.4 金黄色葡萄球菌肠毒素的检测

选用Tecra™微孔板法葡萄球菌肠毒素A-E快速检测试剂盒。为了检测某个时期的搅打奶油中是否有肠毒素出现，每次取1 mL奶油样品和50 μL样品添加液充分混合后，按照Tecra™微孔板法葡萄球菌肠毒素A-E快速检测试剂盒的说明书对样品分析，结果用酶标仪读取吸光度（A），根据试剂盒说明书：将酶标仪的波长调节为405 nm，A405nm≥0.2为阳性，表明产毒，当A405nm＜0.2为阴性，表明不产毒或者分泌肠毒素的量不能达到显示毒性的水平；此时，PC（阳性对照物）的A405nm≥1.0，NC（阴性对照物）的A405nm≤0.2，读数有效。

2 结果与分析

2.1 36 ℃条件下搅打奶油中金黄色葡萄球菌的生长和产肠毒素情况

图1 36 ℃搅打奶油中低接种量水平（a）和高接种量水平（b）下金黄色葡萄球菌的生长以及产毒情况Fig.1 Growth of Staphylococcus aureus and the production of enterotoxin with low (a) and high (b) inoculation levels in whipping cream stored at 36 ℃

由图1可知，36 ℃条件下，无论是低初接种量还是高初接种量的情况下，都能快速进入对数期，无明显的延滞期。低接种量的情况下，初始菌落总数为3.1（lg（CFU/g）），在27 h检测到产毒，此时菌落总数为6.08（lg（CFU/g））；高接种量的情况下，初始菌落总数为4.2（lg（CFU/g）），24 h达到稳定期，菌落总数维持在7.8（lg（CFU/g）），在12 h检测到毒素产生，此时的菌落总数为6.88（lg（CFU/g））。36 ℃条件下，在18 h后，打发成固态的裱花奶油的固态结构已经坍塌并融化成液态，有异味产生，失去食用价值。

2.2 25 ℃条件下搅打奶油中金黄色葡萄球菌的生长状况以及产肠毒素情况

图2 25 ℃搅打奶油中低接种量水平（a）和高接种量水平（b）下金黄色葡萄球菌的生长以及产毒情况Fig.2 Growth of Staphylococcus aureus and the production of enterotoxin with low (a) and high (b) inoculation levels in whipping cream stored at 25 ℃

由图2可知，25 ℃条件下，金黄色葡萄球菌较36 ℃条件下的生长曲线以及产毒情况有着明显不同：低接种量初始菌落总数为3.0（lg（CFU/g）），有明显的延滞期，4 h后达到生长对数期，56 h后尚未达到稳定期，此时菌落总数为5.6（lg（CFU/g））左右，未检测到有毒素产生。高接种量初始菌落总数为4.2（lg（CFU/g）），无明显的延滞期，32 h达到稳定期，菌落总数维持在6.7（lg（CFU/g））左右，在24 h检测到毒素的产生，此时的菌落总数为6.34（lg（CFU/g））。25 ℃条件下，已经打发成固态的裱花奶油在28 h后泡沫结构已坍塌并融化成液态，有异味产生，失去食用价值。

2.3 15 ℃条件下搅打奶油中金黄色葡萄球菌的生长以及产肠毒素情况

图3 15 ℃搅打奶油中低接种量（a）和高接种量（b）水平下金黄色葡萄球菌的生长以及产毒情况Fig.3 Growth of Staphylococcus aureus and the production of enterotoxin with low (a) and high (b) inoculation levels in whipping cream stored at 15 ℃

由图3可知，15 ℃条件下，金黄色葡萄球菌生长缓慢：低接种量情况下，初始菌落总数为2.7（lg（CFU/g）），48 h时开始进入对数期，整个实验生长过程中未检测出有毒素产生。高接种量的情况下，初始菌落总数为4.23（lg（CFU/g））左右，在42 h后开始快速增长，在66 h检测到毒素的产生，此时菌落总数为6.16（lg（CFU/g））左右。15 ℃条件下，在48 h后，大部分已打发成固态的裱花奶油的泡沫结构已坍塌并融化成液态，有异味产生，失去食用价值。

2.4 5 ℃条件下搅打奶油中金黄色葡萄球菌的生长以及产肠毒素情况

由图4可知，5 ℃条件下，无论低接种量和高接种量的情况下，金黄色葡萄球菌几乎不生长或着生长极为缓慢，在整个生长过程中并未检测到有毒素产生，整个过程中已打发的裱花奶油状态没有发生明显的改变。

图4 5 ℃搅打奶油中低接种量（a）和高接种量（b）水平下金黄色葡萄球菌的生长以及产毒情况Fig.4 Growth of Staphylococcus aureus and the production of enterotoxin with low (a) and high (b) inoculation levels in whipping cream stored at 5 ℃

3 讨 论

由上述实验结果可知，温度对金黄色葡萄球菌在搅打奶油的生长以及产肠毒素有着很大的关系，无论是在高接种水平下还是在低接种水平下，金黄色葡萄球菌的生长速率与温度呈现出正相关关系。在36 ℃条件下，金黄色葡萄球菌生长无明显的延滞期，菌种接入后迅速进入对数期；在15 ℃条件下，无论低接种量水平还是高接种量水平，都要经过约40 h的延滞期后进入对数期；而在5 ℃条件下，金黄色葡萄球菌几乎停止了生长。其次，虽然金黄色葡萄球菌的最适生长温度为36 ℃，但在25、15 ℃温度条件下也能产肠毒素，但随着温度的降低，从接入金黄色葡萄球菌菌液到开始产肠毒素的时间也随之延长，在高接种量的条件下，36、25、15 ℃温度时的产毒时间分别为12、24、66 h。但在5 ℃条件下，金黄色葡萄球菌几乎停止生长，也不产毒素。

接种量的高低也是影响金黄色葡萄球菌的生长和产毒素的重要条件，在36 ℃时，无论高低接种量金黄色葡萄球菌的生长均无明显延滞期；在25 ℃时，高接种量也无明显延滞期，而低接种量至少有4 h的延滞期；而在15 ℃条件下，低接种量水平的延滞期要比高接种量水平长6 h。其次，高初始接种量从接入金黄色葡萄球菌菌液到开始产肠毒素的时间要明显短于低接种量，在36 ℃时，高、低接种量的产毒时间分别为12 h和27 h；25 ℃时，高接种量的产毒时间为24 h，而低接种量在60 h尚未产毒；而在15 ℃条件下，高接种量的产毒时间为66 h，而低接种量始终未能检出产毒。无论高低接种量，金黄色葡萄球菌在搅打奶油中产生的毒素的金葡菌菌落总数≥6（lg（CFU/g））。以上结论与Liliana[23]和Aimo[24]等相关研究结果具有一致性，

从上述实验结果还可以发现，金黄色葡萄球菌产肠毒素时间与其生长的阶段密切相关，无论高、低接种量，金黄色葡萄球菌产肠毒素的时间都是在其生长对数期的中晚期，这在Fujikawa等[25]在牛奶中进行的实验结果相近。如果从36 ℃和25 ℃的实验结果做一个更进一步的估算，可以看出金黄色葡萄球菌产肠毒素的时间大约是其对数期的2/3的阶段，此时金黄色葡萄球菌菌落总数≥6（lg（CFU/g））。在本实验中，25 ℃和15 ℃、低接种量的情况下金黄色葡萄球菌毒素均未检出，但如果观察其生长曲线，可发现到实验结束时，其生长尚处于对数期，远未达到稳定期，只是此时的搅打奶油早已失去食用价值而导致实验终止。如果忽略其食用价值而延长实验，在25 ℃和15 ℃、低接种量的情况下金葡菌肠毒素还是存在检出的可能性。

综上所述，搅打奶油是金黄色葡萄球菌良好的培养剂，一旦受到污染并且条件适宜，金黄色葡萄球菌生长迅速并且在较短的时间就可产生肠毒素；即便是较低的贮藏温度条件（15 ℃），依然不能完全阻止金黄色葡萄球菌的生长和产肠毒素。因此作为使用搅打奶油的食品企业必须做好操作环节的卫生，尽可能减少和防止的金黄色葡萄球菌污染，同时产品必须贮存于5 ℃以下的环境中，并且要防止温度波动，这样方可有效防止由金黄色葡萄球菌导致的食物中毒事件。

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Effects of Storage Temperature and Inoculum Amount on the Growth of Staphylococcus aureus and Production of Enterotoxin in Whipping Cream

WANG Tong1, LIN Lu2, YAN Wei-ling2,*, OU Jie1, CHEN Min3
(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Shanghai Food Research Institute, Shanghai 200235, China; 3. Shanghai Municipal Center for Disease Control and Prevention, Shanghai 200336, China)

Objective: The growth of Staphylococcus aureus and the production of enterotoxin in whipping cream were studied. Methods: Two concentration levels of Staphylococcus aureus which produce enterotoxin were inoculated into whipping cream stored at different temperatures; the low initial inoculum level was controlled in 2-3 (lg(CFU/g)), and the high level was over 4 (1g(CFU/g)). The plate counts of Staphylococcus aureus and staphylococcal enterotoxin were tested regularly. Results: The growth rate decreased with decreasing temperature. At the low inoculation level, Staphylococcus aureus enterotoxin was detected only at 36 ℃ after 27 h. At the moderate temperature (25, 15 ℃), no Staphylococcus aureus enterotoxin was detected. At the high inoculation level, staphylococcus enterotoxin were detected at 36 ℃after 12 h, 25 ℃after 24 h and 15 ℃ after 66 h. At the low temperature (5 ℃), Staphylococcus aureus did not grow and no staphylococcus enterotoxin was detected. Conclusion: As temperature rose, the growth rate of Staphylococcus aureus increased and the time to produce enterotoxin was shortened. The time to produce enterotoxin for Staphylococcus aureus at the high initial inoculation level was shorter than at the low initial inoculation level. The enterotoxin was generated in the late lag phase where the plate count of Staphylococcus aureus reached 6 (1g(CFU/g)).

Staphylococcus aureus; enterotoxin; whipping cream

TS252.52

A

1002-6630（2014）23-0210-05

10.7506/spkx1002-6630-201423041

2014-06-25

上海市科委应用技术开发专项资金项目（2013-116）

王彤（1989—），男，硕士研究生，研究方向为食品工程。E-mail：1007944467@qq.com

*通信作者：严维凌（1967—），男，教授级高级工程师，本科，研究方向为食品安全和控制。E-mail：yanwling@tom.com