UPLC 法同时测定吸烟者尿液中苯乙醛酸和苯乙醇酸含量

石龙凯，杨 进，张小涛，侯宏卫*，胡清源*

1.国家烟草质量监督检验中心，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号 450001

2.河南工业大学粮油食品学院，郑州高新技术产业开发区莲花街1号 450001

苯乙烯虽然毒性低，但可引起人体内循环系统的损伤［1-8］，国际癌症研究机构将其列为Group 2B 类，即对人类为可能致癌物［2］，半数致死剂量为5000 mg/kg（大鼠经口）［3］；它是广泛存在于卷烟烟气中的一种半挥发性化合物［9-12］。吴银菊等［13］测定了卷烟烟气中的苯乙烯含量，方法的线性范围为0.1～0.8 μg/mL，检出限为0.03 ng/支。苯乙烯在烟气粒相物和气相物中均有分布，通常使用剑桥滤片和低温冷阱同时捕集，再通过热脱附或溶剂萃取后进行定量分析［12］，但操作繁琐，对装置要求苛刻。近年来，溶液吸收捕集方法逐渐发展起来，庹苏行等［9］以甲醇为吸收溶液，采用气质联用法测定了烟气中的苯乙烯含量，过程简便快捷，结果准确可靠。进入人体内的苯乙烯在细胞色素P450 酶的作用下代谢为苯乙醛酸（phenylglyoxylic acid，PGA）和苯乙醇酸（mandelic acid，MA）（PGA 和MA 的结构式见图1），并能随尿液排出［14］，故二者可以作为苯乙烯暴露剂量的生物标志物［15］，即它们在人体代谢物中的检出含量可反映机体受苯乙烯污染的程度，特别是当二者都能检测到时可信度更高。目前，尿液中苯乙烯代谢物的检测方法主要有分光光度法［16-17］、气相色谱法［14,18-20］、液相色谱法［21-29］、气质联用法［13,19,30］和液质联用法［15,31］等；其中，液相色谱法应用最为广泛。但是尿液样本基质复杂，目标物分离分析的效果不佳，分析时间长。因此，建立了测定吸烟与非吸烟者尿液样本中PGA 和MA 含量的超高效液相色谱（UPLC）法，旨在为监控吸烟人群尿液中苯乙烯代谢物的含量提供技术支持。

图1 苯乙醛酸和苯乙醇酸的结构式

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

共50 个尿液样本，其中吸烟者和非吸烟者尿液样本各25 个，由郑州大学国家药品临床研究基地提供。所有志愿者在参加试验前均须签署一份知情同意书，志愿者为年龄在21～60 岁之间身体健康的成年男性。其中，吸烟者每人每天吸食15 支卷烟，非吸烟者不做处理；收集其24 h 尿液，储存于－80 ℃冰箱中备用。

苯乙醛酸标准品（98%，加拿大Toronto Research Chemicals 公 司）；苯乙醇酸标准品（99.5%，美 国ChemService 公司）；二氯甲烷、异丙醇、甲醇（色谱纯，韩国DUKSAN Pure Chemicals 公司）；醋酸（99.7%，美国TEDIA 公司）；磷酸（85%，天津科密欧试剂有限公司）；盐酸（36～38%，山东双双化工有限公司）；超纯水（自制）。

ACQUITY UPLC 超高效液相色谱仪，配有ACQUITY UPLC Sample Manager-FTN 进样系统，ACQUITY UPLC H class Quaternary Solvent Manager 四元混合泵，ACQUITY UPLC PDA 检测器和Empower 3 软件数据处理系统（美国Waters 公司）；AL104 电子分析天平（感量0.0001 g，梅特勒-托利多仪器有限公司）；VX-2500 型涡旋振荡器（美国HENRY TROEMNER LLC公司）；3-30K 型台式高速冷冻离心机（德国SIGMA 公司）；TurboVap LV 型氮吹浓缩仪（瑞士BIOTAGE 公司）；Milli-Q 超纯水机（美国Millipore 公司）；微孔水相滤膜（0.22 μm，上海安谱科学仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 0.01%混合酸水溶液的配制

分别量取1.0 mL 醋酸和1.0 mL 85%磷酸于250 mL烧杯中，稀释至100 mL，置4 ℃冰箱避光保存；用时取10 mL 用水稀释至1 L，即为0.01%混合酸水溶液。

1.2.2 样本处理与分析

尿液样本于室温下解冻，混合均匀，经水相滤膜过滤，取1.0 mL 尿液置于10 mL 离心管中，加入1.0 mL 6 mol/L 的盐酸和4.0 mL 混合萃取溶液（二氯甲烷∶异丙醇=9∶1，体积比），2000 r/min 涡旋振荡提取3 min，10000 r/min 离心分离1 min，取1.0 mL 下层有机相置于玻璃试管中，40 ℃氮吹至干，加入0.2 mL 色谱分析时的流动相复溶，取5 μL 采用UPLC 法分离分析。分析条件为：

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC®BEH（50 mm × 2.1 mm，1.7 µm）色谱柱；流动相A：甲醇；流动相B：0.01%混合酸水溶液；洗脱条件：等度洗脱，A:B=15:85（体积比）；柱温箱温度：30 ℃；流动相流速：150 μL/min；分析时间：8 min；进样量：5 μL；光电二极管阵列检测器波长：苯乙醇酸225 nm,苯乙醛酸254 nm。

1.2.3 数据处理

采用SPSS16.0 统计学软件对数据进行方差分析及处理。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 检测波长

尿液样本基质复杂，许多杂质会在短波区产生吸收，影响检测器对目标物的测定。为了避免干扰，实验采用双波长光电二极管阵列检测器，在254 nm 处检测苯乙醛酸、225 nm 处检测苯乙醇酸时目标物响应最大且无干扰。此时，标准溶液中苯乙醛酸和苯乙醇酸的保留时间分别为2.083 和3.792 min；尿液样本中二者的保留时间分别为2.091 和3.803 min。苯乙醛酸和苯乙醇酸的标准色谱图见图2 所示。

2.1.2 流动相

图2 苯乙醛酸（a）和苯乙醇酸（b）的标准色谱图

目标物苯乙醛酸和苯乙醇酸属于弱的有机酸类化合物，本研究选择甲醇-混合酸水溶液作为流动相进行考察。实验结果表明，流动相中的醋酸可以有效地减小色谱峰拖尾并抑制目标物的离子化，改善峰形的对称性，而磷酸能够显著增强两种目标物在色谱柱上的保留能力，使分离分析效果更出色。分别考察了20∶80,15∶85 和10∶90（体积比）甲醇-混合酸水溶液3 种流动相体系，通过分析目标物的保留时间、分离度等因素，最终确定以甲醇-混合酸水溶液（15∶85，体积比）为流动相，等度洗脱。各组分能够很好分离且峰形良好，所有目标物在8 min 内均可洗脱完全，提高了分析测试效率；而且以酸代替盐作为改性剂能够延长色谱柱的使用寿命，减少仪器系统的维护难度。

2.1.3 色谱柱

实验考察了Agilent ZORBAX Eclipse plus C18(100 mm×2.1 mm，1.5 μm)，Waters ACQUITY UPLC®BEH(50 mm×2.1 mm，1.7 µm)，Waters ACQUITY UPLC®BEH(100 mm×2.1 mm，1.7 µm) 3 种色谱柱对尿液样本中苯乙醛酸和苯乙醇酸的分离效果，其中ACQUITY UPLC®BEH(50 mm×2.1 mm，1.7 µm)色谱柱对两种目标物的色谱分离峰型最好（见图2），可满足定性、定量分析要求。

2.2 工作曲线和检测限

分别称取42.5 mg 苯乙醛酸和100.0 mg 苯乙醇酸标准品，置于两个不同的10 mL 棕色容量瓶中，用超纯水定容至刻度，得到4.25 mg/mL 苯乙醛酸和10.00 mg/mL苯乙醇酸标准储备溶液，于4 ℃下避光保存。分别准确移取1 mL 上述储备溶液，置于两个不同的10 mL 棕色容量瓶中，用超纯水定容至刻度，得到0.425 mg/mL 苯乙醛酸和1.000 mg/mL 苯乙醇酸标准工作溶液，于4 ℃下避光保存。

准确移取苯乙醛酸标准工作溶液10,20,100,200 和500 μL 于5 个10 mL 棕色容量瓶中，用超纯水定容至刻度，得到0.425,0.850,4.250,8.500 和21.250 μg/mL 苯乙醛酸系列标准溶液；准确移取苯乙醇酸标准工作溶液10,20,100,200 和1000 μL 于5 个10 mL 棕色容量瓶中，用超纯水定容至刻度，得到1,2,10,20 和100 μg/mL 苯乙醇酸系列标准溶液。

将以上制备的一系列标准溶液在优化好的实验条件下分析测定，以目标物的质量浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标作图，得到苯乙醛酸和苯乙醇酸的线性回归方程分别为y=1.12×105x+1.36×104和y=1.94×104x－2.48×103，其中y 代表目标分析物的峰面积，x 表示尿液样本中目标分析物的浓度（μg/mL），线性相关系数分别为0.9995 和0.9998。结果表明，目标物在0.425～21.500 和1～100 μg/mL 的浓度范围内具有良好的线性关系。利用加标稀释法得到方法的定量限（S/N=10）和检出限（S/N=3），苯乙醛酸和苯乙醇酸的定量限分别为0.013 和0.077 μg/mL。

2.3 回收率和精密度

采用尿液基质加标准品的方法测定方法的回收率和精密度。选取10 个尿液样本，混合均匀以后，选取低、中和高3 个添加水平加入标准品，每个浓度平行做6 次重复，按照优化好的处理方法及检测条件测定方法的回收率［以相对标准偏差（RSD）计］，结果见表1。由表1 可知，方法的回收率范围是86.67～97.17%，RSD 均小于8%。表明方法的回收率好，可以满足分析测试要求。

以上述不同浓度加标尿液样品在一天内平行测定5 次，计算日内精密度；每天对样品进行测定，连续测定5 天，计算日间精密度，均以RSD 计，结果见表1。结果表明方法的精密度良好，可以满足分析测试要求。

表1 苯乙醛酸和苯乙醇酸在尿液样本中的回收率和精密度

2.4 方法应用

图3 尿液样本中苯乙醛酸（a）和苯乙醇酸（b）的色谱图

实验测定的尿液样本中苯乙醛酸和苯乙醇酸的色谱图见图3，测定结果见表2。吸烟者尿液样本中苯乙醛酸的平均含量（以平均值±标准偏差计，下同）为(0.575±0.44) μg/mL，苯乙醇酸的平均含量为(2.519±1.58)μg/mL；非吸烟者尿液样本中苯乙醛酸的平均含量为(0.0359±0.026) μg/mL，苯乙醇酸 的平均含量为(0.437±0.34) μg/mL。其中吸烟者尿液样本中苯乙醛酸和苯乙醇酸的检出率分别为96%和100%，非吸烟者尿液样本中苯乙醛酸和苯乙醇酸的检出率分别为80%和88%。

表2 吸烟者与非吸烟者尿液样本中苯乙醛酸和苯乙醇酸的含量

总体来看，本方法的测定结果与相关文献［19,23-24］报道的尿液中苯乙醛酸和苯乙醇酸的含量范围相一致。吸烟者尿液样本中苯乙醛酸和苯乙醇酸的含量皆高于非吸烟者，且方差分析(Analysis of Variance,ANOVA)结果表明，二者之间呈现显著性差异（P<0.05）。从图4 可知，不管是吸烟者还是非吸烟者的尿液样本中，苯乙醇酸的含量皆高于苯乙醛酸。分析原因可能与二者的代谢路径有关，苯乙醇酸在抗利尿激素（乙醇脱氢酶）的作用下才会脱氢产生苯乙醛酸，因此苯乙醛酸的含量会受到人体内乙醇脱氢酶代谢水平的影响。实验中发现非吸烟者尿液样本中两种苯乙烯代谢产物会产生个别离散现象（见图4 中点7 和点12），这可能与个体之间的代谢水平差异有关，也可能与其他苯乙烯暴露途径有关。

图4 吸烟者与非吸烟者尿液样本中苯乙醛酸和苯乙醇酸含量箱型统计结果

3 结论

①超高效液相色谱法测定吸烟者和非吸烟者尿液样本中苯乙醛酸和苯乙醇酸的检出限分别为0.013 和0.077 μg/mL，目标物与尿液样本杂质分离效果良好，操作简便，分析时间大大缩短，方法的回收率以及精密度皆能满足实验要求。②对受试者尿液样本的测定结果表明，吸烟者尿液样本中苯乙醛酸和苯乙醇酸含量皆高于非吸烟者，且二者呈显著性差异（P<0.05）。③本方法的建立可以有效地监控吸烟人群尿液中苯乙烯代谢物的含量。

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