Maillard 反应生成DDMP 的影响因素

徐华军，陈良元，徐迎波，徐志强，李 鲁，邹 鹏，张李明，夏 虹

1.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，郑州市东风路5号 450001

2.安徽中烟工业有限责任公司技术中心，合肥市高新区天达路9号 230088

3.中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号 450001

自Mills［1］首次从Maillard 反应产物中鉴定出2,3-二氢-3,5-二羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮（2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one,DDMP）以 来，人们从DDMP 的形成机理到DDMP 的生理学功能等多个方面开展了大量的研究工作［2-4］。DDMP 主要通过还原糖和氨基酸的Maillard 反应生成，形成于一些食品的常规烹饪、烘烤过程中［5-8］。单糖（己糖）脱水也有可能形成DDMP，但是产率较低［9］。研究发现，云南地区烤烟烟气中的DDMP 显著高于其他地区，与烟气的甜味显著正相关。虽然人们在DDMP 形成机理方面已经做了大量研究工作，但是这些研究主要通过液体介质进行，不能模拟卷烟燃烧过程。为此，采用干热方法模拟卷烟抽吸过程，研究了氨基酸与葡萄糖/果糖在不同反应条件下对DDMP 生成量的影响。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

“黄山”牌卷烟产品G#（三类卷烟）和B#（二类卷烟）未加香配方烟丝（安徽中烟工业有限责任公司提供）。

D-葡萄糖、D-果糖、无水硫酸钠（AR，国药集团化学试剂有限公司）；脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）、天冬酰胺（Asn）、苏氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr）（高纯试剂，合肥博美生物科技有限责任公司）；乙酸苯乙酯（AR，百灵威化学技术有限公司）；食用乙醇（95%，安徽丰原集团）。

Agilent 6890N/5975 气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent 公司）；BSA2245-CW 电子分析天平（感量：0.0001 g，德国Sartorius 公司）；DK 消解仪（意大利VELP公司）。

1.2 方法

1.2.1 DDMP 的制备和分析

取一定量的氨基酸与D-葡萄糖或D-果糖按照不同摩尔比混合，在研钵中研磨混匀。将混合物转移至具塞耐压试管中，充入含有一定量氧气的氮气，密闭，置于DK 消解仪中，控制不同反应条件；反应完成后冷却至室温，加入1 g 无水硫酸钠除去水分，加入20 mL 二氯甲烷超声萃取15 min，过滤除去不溶物；加入200 μL 100 µg/mL 的乙酸苯乙酯内标，减压浓缩至1 mL，进行GC/MS 色谱分析。分析条件［10-11］为：

色谱柱：H P-5MS 毛细管柱（30m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度：240℃；载气：H e；恒流模式：1.0mL/min；程序升温：进样量：1 μL；分流比：10:1；传输线温度：280℃；电离方式：EI；电离能量：70eV；离子源温度：230℃；四级杆温度：160℃；扫描范围：50～450 amu；溶剂延迟：2min；检测模式：S C A N。

所得图谱经计算机谱库（NIST05,Wiley275）检索，并结合标准图谱和有关文献，确定DDMP 的结构。DDMP 的含量采用内标法定量。

1.2.2 DDMP 在卷烟中的应用

准确称取适量DDMP 反应产物，加入10 mL 70%乙醇，搅拌溶解。用微量喷雾器均匀施加到黄山G#和B#两个未加香配方烟丝上，将烟丝卷制成烟支，放入温度（22±1）℃和湿度（60±2）%的恒温恒湿箱内平衡48 h 以上，选择15 名拥有国家烟草专卖局颁发的卷烟感官评吸技术合格证书的专业人员组成评价小组，按照GB 5606.4—2005［12］的方法分别从香气质、香气量、杂气、刺激性和余味等方面对加香效果进行评价，对照样烟为加入等量70%乙醇烟丝卷制成的卷烟。

2 结果及讨论

2.1 影响卷烟燃烧过程中DDMP 生成量的因素

2.1.1 氨基酸种类

烤烟中含有多种游离氨基酸［13］，其中以脯氨酸和天冬酰胺的含量最高，其次是丙氨酸、酪氨酸以及苏氨酸等。取1 mmol 的脯氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸和酪氨酸，分别与D-葡萄糖或D-果糖按照摩尔比1∶1的比例混合，在10%氧气的氮气环境中，150 ℃反应10 min。DDMP 的生成量结果见表1。由表1 可知，5 种氨基酸中，酪氨酸与糖反应的DDMP 生成量都很低，这可能是由于酪氨酸分子中苯环阻止酪氨酸重排而造成的。丙氨酸与果糖反应的DDMP 生成量最高，脯氨酸次之。总体来说，D-果糖反应体系的DDMP 生成量高于D-葡萄糖反应体系，但是酪氨酸例外。同时酪氨酸、脯氨酸分别与D-果糖和D-葡萄糖反应的DDMP 生成量差别相对较小。由于在烤烟型烟叶中丙氨酸含量较低［13］，因此，选择脯氨酸进行其他条件实验。

表1 氨基酸种类对DDMP 生成量的影响

2.1.2 氧气浓度

卷烟在抽吸过程中，燃烧区的氧气含量从卷烟纸到燃烧区中心递减，其平均氧气含量约为9%［14］。实验选取了氧气含量分别为0,5%,10%,15%和20% 5 个浓度的氮气环境模拟卷烟抽吸过程，单糖与脯氨酸摩尔比1:1，实验温度150 ℃，反应时间10 min，DDMP 生成量变化情况见图1。由图1 可知，氧气浓度对D-葡萄糖-脯氨酸反应体系中DDMP 的生成量没有显著影响；而对D-果糖-脯氨酸反应体系的影响较大，随着氧气含量的增加，DDMP 的生成量显著下降，并在氧气含量为10%时下降到最低点。考虑到卷烟燃烧区平均氧气浓度实际情况，选择氧气浓度为5%～15%进行正交实验研究。

2.1.3 反应时间

图1 氧气浓度对DDMP 生成量的影响

不同的反应时间会影响到Maillard 反应的进程，进而影响DDMP 的生成量。在相同的物料比、反应温度和反应环境条件下进行实验，发现不同反应时间对DDMP 的生成量有显著影响，结果如图2。从图2 可知，在反应2 min 时还没有DDMP 生成，随着反应时间的延长，DDMP 的生成量逐渐增加，其中D-葡萄糖在8 min，D-果糖在6 min 时，DDMP 的生成量达到最大值；而后，随着反应时间的延长，DDMP 含量逐步下降，这可能是由于DDMP 逐步裂解成为其他香味成分所致［15］。

图2 反应时间对DDMP 生成量的影响

2.1.4 反应温度

图3 是在其他反应条件固定的情况下，D-果糖、D-葡萄糖与脯氨酸在不同温度下反应DDMP 的生成量结果。由图3 可以看出，反应温度对DDMP 生成量有显著的影响。在100 ℃时，由于单糖不能熔化发生反应，DDMP 生成量极低；随着温度逐步上升，反应快速进行；在150 ℃时，DDMP 生成量达到最高。而当温度上升到200 ℃以上时，由于高温下，果糖/葡萄糖在进行Heyns或Amadori 重排前就已经分解为小分子化合物，这些小分子化合物随后直接与氨基酸反应生成了类黑精等，造成两种反应体系中DDMP 的含量均出现了比较明显的下降；其中，葡萄糖-脯氨酸反应体系下降更为显著，DDMP 的含量只有150 ℃时的30%左右。因此，选择150 ℃为合成DDMP 适宜的反应温度，这与文献［16］报道的DDMP 主要在较低温度条件下生成的结果基本一致。

2.1.5 物料摩尔比

图3 反应温度对DDMP 生成量的影响

图4 为其他反应条件固定，葡萄糖/果糖与脯氨酸摩尔比分别为1:3,1:2,1:1,2:1 和3:1 时，DDMP 生成量变化情况。从图4 可以看出，随着单糖添加量的增加，DDMP 的生成量呈现逐步上升的趋势，并且在摩尔比为2:1 时达到最高值；而后随着单糖添加量的增加，DDMP的生成量又出现了下降。

总体来说，果糖反应体系的DDMP 生成量高于葡萄糖反应体系，并且物料摩尔比对果糖反应体系的影响要远远大于葡萄糖反应体系，特别是当果糖/脯氨酸摩尔比从1:1 上升到2:1 时，DDMP 生成 量急剧上升，物料摩尔比的影响极其显著。

图4 糖与脯氨酸摩尔比对DDMP 生成量的影响

2.2 正交实验确定的最佳反应条件

前面的单因素实验讨论了各单因子的影响，由于在实际反应中，各个因子对反应存在交叉影响，因此，为了全面考察影响因素，以果糖-脯氨酸为反应体系，设计了4 因素3 水平的L9（34）正交实验，因素水平和正交实验结果见表2。

通过正交实验和数据处理结果表明，影响Maillard反应生成DDMP 因素的主次顺序为：A＞B＞D＞C，即氧气浓度对DDMP 生成量影响最大，果糖与脯氨酸之间的摩尔比影响次之，反应温度影响相对较小。最佳反应条件为：A1B2C2D2，即氧气浓度5%，果糖与脯氨酸摩尔比2:1，反应时间7 min，反应温度150 ℃。准确称取2 mmol 果糖和1 mmol 脯氨酸，在正交优化实验条件下平行实验3 次，得到DDMP 的生成量分别为2736.28,2695.74 和2715.30 μg。反应得到 的DDMP 的平均生 成量为2715.77 μg。

表2 L9（34）正交实验结果

2.3 应用效果评价

添加不同比例优化条件下DDMP 反应产物的卷烟样品的评价结果见表3。由表3 可知，与对照卷烟相比，添加DDMP 卷烟的香气质和香气量增加，杂气减少，同时刺激性降低，余味的干燥感和甜润感有不同程度的改善。DDMP 在黄山卷烟中的用量为0.05%（质量比）时效果最好。

表3 加香卷烟评吸结果

3 结论

①不同氨基酸种类对DDMP 的形成起着非常显著的影响，丙氨酸与果糖、脯氨酸与葡萄糖/果糖反应生成DDMP 的量较高。②在脯氨酸-果糖反应体系中，在氧气浓度5%，果糖/脯氨酸摩尔比2:1，反应时间7 min，反应温度150 ℃，DDMP 的生成量最高。③在配方烟丝中添加0.05%（质量比）DDMP 能够增加卷烟香气量，提高香气质，并改善烟气的味觉特征。

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