不同剂量瘦素对2型糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响研究

余 帆，徐彤彤，佐 妍，吕祥威

糖尿病作为临床上一种常见的慢性代谢性疾病，其发病率已随着人们生活水平的提高而逐年增加。糖尿病常伴发或并发各种心血管疾病，譬如心肌缺血、心肌梗死及猝死[1-2]。这一高危因素，已逐渐引起学者重视。近年来瘦素与胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)在心血管疾病中的作用备受关注[3-4]，目前国内就两者在糖尿病并发心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemic reperfusion injury,MIRI)过程中的相关作用报道较少。本研究旨在通过复制糖尿病大鼠MIRI模型，观察不同剂量外源性瘦素预处理对大鼠血清瘦素、肿瘤坏死因子α(tumor necrosisfactor-alpha,TNF-α)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)及胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)的影响，探讨瘦素预处理在糖尿病大鼠MIRI中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器 (1)实验动物：清洁级SPF雄性SD成年健康大鼠60只，8周龄，体质量170～190 g，由桂林医学院动物实验中心提供，许可证号：SCXK 桂 2013-0001。动物饲养条件：室温18～25 ℃，相对湿度50%～80%的环境下，每天日照时间为8:00-20:00。(2)主要药品和试剂：链脲佐菌素(streptozotocin,STZ，100 mg，美国sigma公司 S0130)，重组瘦素(200 μg,Leptin，美国R&D Systems公司)，MDA、TNF-α酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(均为100管/96T，南京建成生物工程研究所)，瘦素放射免疫分析盒(100管/96T，中国原子能科学研究所)，125I-胰岛素放射免疫分析药盒(100管/盒，北京科美生物技术有限公司)。(3)主要仪器：血糖仪(罗氏，卓越型)、小型动物呼吸机、Leica显微镜、超声匀浆机、高速离心机、电子秤和BECKMAN全自动生化分析仪。

1.2 饲料 普通饲料由医学院动物实验中心提供。高糖高脂饲料配方为每100.0 g饲料中含标准饲料粉25.5 g、酵母粉0.5 g、大豆粉10.0 g、食盐0.5 g、猪油15.0 g、蔗糖20.0 g、奶粉10.0 g、麻油5.0 g、蛋黄粉10.0 g、花生10.0 g。将上述配料充分混匀，烤熟压制成形后喂养，此饲料喂养前临时配制。

1.3 分组方法及模型制备 (1)60只健康大鼠按照随机数字表法分为正常对照组、糖尿病假手术组、糖尿病假手术心肌梗死模型组(心肌梗死组)、糖尿病心肌梗死低剂量瘦素预处理组(低剂量组)、糖尿病心肌梗死中剂量瘦素预处理组(中剂量组)、糖尿病心肌梗死高剂量瘦素预处理组(高剂量组)，每组各10只。正常对照组采用普通饲料喂养4周，而糖尿病5组均采用高糖高脂喂养4周后，禁食12 h腹腔注射STZ(STZ溶于pH值4.2的0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液)35 mg/kg，注射药物72 h后大鼠尾静脉采血测定血糖，以随机血糖>16.7 mmol/L且持续1周为造模成功。各组大鼠在术前均禁食10 h。(2)大鼠心肌梗死模型的制备采用结扎大鼠冠状动脉左前降支。大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉，切开颈部正中皮肤，钝性分离肌肉至气管。气管插管接小型动物呼吸机(呼吸频率为72次/min)。大鼠冠状动脉左前降支开胸结扎：在胸骨左侧2～3 mm处切开皮肤，皮下钝性分离，暴露心脏，钝形分离第二肋间隙肋间肌。小心暴露心脏，剪开心包膜，用0.9%氯化钠溶液沾湿的棉签轻压心脏。以无创小圆针进针(5-0丝线)在左心耳下缘内侧1～2 mm处，深度约为1 mm，经由肺动脉圆锥右上方出针，留线垫置硅胶管。心肌梗死成功标志为：直视下可见被结扎血管供应区心肌变为苍白色或肿胀。缺血30 min后松开线结，开放血管再灌注，缝线保留。糖尿病假手术组不结扎冠状动脉前降支，仅留线。(3)正常对照组空腹取血清及心脏标本。糖尿病各组均在心肌梗死手术后3 h取大鼠血清及心脏标本，测定大鼠血清空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)、瘦素、HOMA-IR、TNF-α、MDA及血脂水平。

1.4 标本制作 术后3 h大鼠腹腔静脉取血5 ml，摇匀，抗凝，4 ℃，1 000 r/min低温离心8 min(离心半径10 cm)，分离血清置于-70 ℃冰箱保存待测。大鼠左心室心底部取心肌，50 mg心肌放入0.5 ml 0.9%氯化钠溶液中，用超声匀浆机液氮低温状态下制备心肌匀浆。取大鼠左心室前壁肌组织，石蜡包埋、切片、苏木素-伊红(HE)染色，显微镜下观察各组大鼠心肌细胞形态学。

1.5 实验室指标测定 采用静脉葡萄糖氧化酶法测定随机血糖、FBG；采用放射免疫法测定FINS和瘦素；采用ELISA测定血清TNF-α；采用HPLC法测定MDA；使用BECKMAN全自动生化分析仪检测三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)；HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。

2 结果

2.1 各组大鼠FBG、FINS、瘦素水平、HOMA-IR比较 与正常对照组相比，糖尿病假手术组、心肌梗死组、低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠FBG、FINS、瘦素水平及HOMA-IR均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与糖尿病假手术相比，心肌梗死组、低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠FBG及瘦素水平均升高，心肌梗死组、高剂量组大鼠FINS及HOMA-IR均升高，低剂量组、中剂量组大鼠FINS及HOMA-IR均降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与心肌梗死组相比，低剂量组、中剂量组FBG、FINS、瘦素水平及HOMA-IR均降低，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.2 各组大鼠TNF-α、MDA及血脂水平比较 与正常对照组相比，糖尿病假手术组、心肌梗死组、低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠TNF-α、MDA、TG、TC、LDL-C水平均升高，HDL-C水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与糖尿病假手术组相比，心肌梗死组大鼠TNF-α、MDA水平升高，低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠TNF-α、MDA、HDL-C水平升高，而TG、TC、LDL-C水平均降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与心肌梗死组相比，低剂量组、中剂量组大鼠TNF-α、MDA、TG、TC、LDL-C水平均降低，HDL-C水平均升高，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

2.3 心肌组织病理学结果 病理学显示，与正常对照组相比，糖尿病假手术组心肌细胞肥大、变形，部分心肌纤维排列紊乱，局部坏死，有中性粒细胞聚集现象；心肌梗死组心肌纤维排列紊乱，呈不规则分布，细胞结构依稀可见，心肌呈片状局灶性坏死、出血，并有大量中性粒细胞聚集；中剂量组心肌细胞肥大、心肌组织结构紊乱，出血坏死灶与中性粒细胞聚集明显减少，病变明显改善；低剂量组病变有相同改善，但程度远不及中剂量组；高剂量组心肌细胞肥大、心肌组织结构紊乱、细胞形态依稀可见，出血坏死灶及中性粒细胞聚集情况改变不明显(见图1)。

3 讨论

糖尿病相关死亡病因中心血管并发症占据大部分，其中又以缺血性心脏病为主[5-6]。糖尿病患者心力衰竭、再次心肌梗死的发生率及病死率都是非糖尿病患者的数倍。MIRI发病机制十分复杂，研究表明炎性因子浸润、氧自由基增多、细胞内钙超载等与其密切相关，在心肌细胞缺血纠正后可发生超微结构不可逆性坏死等[7]。而糖尿病作为心血管疾病独立危险因素，可导致心肌结构与功能的改变，使得心肌对缺血再灌注的耐受性降低。既往研究表明，2型糖尿病在这一慢性病理状态下可发生IR，通过抑制胰岛素信号转导和葡萄糖转运，降低心肌对葡萄糖的利用，影响心肌代谢，进一步使ATP合成减少，损伤心肌组织[8-9]。

表1 各组大鼠FBG、FINS、瘦素水平及HOMA-IR比较

注：FBG=空腹血糖，FINS=空腹胰岛素，HOMA-IR=胰岛素抵抗指数；与正常对照组比较，*P<0.05；与糖尿病假手术组比较，△P<0.05；与心肌梗死组比较，▲P<0.05

表2 各组大鼠TNF-α、MDA及血脂水平比较

注：TNF-α=肿瘤坏死因子α，MDA=丙二醛，TG=三酰甘油，TC=总胆固醇，LDL-C=低密度脂蛋白胆固醇，HDL-C=高密度脂蛋白胆固醇；与正常对照组比较，*P<0.05；与糖尿病假手术组比较，△P<0.05；与心肌梗死组比较，▲P<0.05

图1 各组大鼠心脏病理学改变(HE，×400)

瘦素作为参与调控机体摄食、体温、能量平衡的神经肽类物质，在脂类代谢、胰岛素分泌等内分泌免疫机制中起重要调节作用，且与IR、糖及脂质代谢异常等密切相关[10]。研究证实，体内存在“脂肪-胰岛素”内分泌轴[11]，通过这个内分泌轴，瘦素和胰岛素对机体代谢发挥着双向调节作用，瘦素的缺乏与过多均可导致IR。在MIRI过程中，瘦素水平会升高，高水平瘦素不仅可通过增强核因子κB (NF-κB)与活性蛋白的活性，导致炎症反应加剧，还可促使内皮细胞内皮素1(ET-1)高表达而使血管痉挛，进一步加重心肌损伤[12]。

炎症作为连接糖尿病和冠状动脉粥样硬化性疾病的纽带，在相关疾病发病机制中发挥着媒介与预测作用[13-14]。炎性因子可通过减弱胰岛素信号转导中的酪氨酸磷酸化参与到IR发生机制之中。而TNF-α是体内炎症反应的重要递质，能诱导IR的产生，其可能通过抑制胰岛素信号传导与葡萄糖转运因子4(GLUT-4)mRNA的表达，削弱相关受体的亲和力[11，15]。同时，TNF-α还可通过促使中性粒细胞在缺血心肌组织的聚集、堵塞毛细血管，并释放大量氧自由基和蛋白水解酶等物质，导致血管通透性的改变引发水肿进而加重心肌损伤[16-17]。

高糖与缺血再灌注时均可诱导细胞内大量氧自由基的生成，使机体处于氧化应激状态，过多的氧自由基不仅可通过脂质过氧化反应损伤细胞膜，而且能诱导凋亡相关因子的释放及心肌细胞线粒体膜通道的开放启动瀑布式凋亡反应[18-19]，还可影响胰岛素传导系统中蛋白质磷酸化的过程，加重IR状态[20]。随着细胞内氧自由基增多，其代谢产物也增多。MDA作为细胞内最重要的脂质过氧化代谢产物，其水平能反映心肌细胞脂质过氧化程度与氧自由基活性[21]。

本实验选取糖尿病MIRI大鼠模型，分别给予不同剂量外源性瘦素进行干预。与正常对照组相比，糖尿病5组大鼠的FINS、瘦素、HOMA-IR、TNF-α与MDA水平均升高；与糖尿病假手术组相比，心肌梗死组大鼠3 h后，FINS、瘦素、HOMA-IR、TNF-α及MDA水平升高；而与心肌梗死组相比，低剂量组与中剂量组3 h后，FINS、瘦素、HOMA-IR、TNF-α及MDA水平下降；而高剂量组3 h后FINS、瘦素、HOMA-IR、TNF-α及MDA水平不降反而升高。结果表明：在MIRI时，低、中剂量瘦素预处理可通过减少缺血心肌炎性因子与氧自由基产生，而降低TNF-α、MDA水平；并通过下调机体内实际瘦素水平，发挥由瘦素与胰岛素介导的“脂肪-胰岛素”内分泌轴激素双向调节反馈作用，并可能因此改善由TNF-α、氧化应激及高瘦素水平所介导的IR状态[22]，而发挥心肌保护作用。然而，高剂量瘦素预处理并未降低机体内实际瘦素水平，反而进一步升高机体瘦素水平，加剧炎性反应、氧化应激状态及IR，加重糖尿病心肌在缺血再灌注的损伤程度。

2型糖尿病患者普遍存在不同程度的脂质代谢紊乱，脂质代谢紊乱是2型糖尿病患者并发急性冠状动脉事件的危险因素之一[23]。高脂血症也可影响胰岛素受体磷酸激酶的活性和GLUT-4的转位，导致IR，且TG水平与IR密切相关，其机制可能为：脂毒性所导致的胰岛细胞功能障碍[24]。本实验显示，与正常对照组相比，糖尿病5组大鼠血脂TG、TC与LDL-C水平升高，HDL-C水平降低；心肌梗死组与糖尿病假手术组相比，血脂检测各项指标水平无差异；与心肌梗死组相比，低剂量组与中剂量组3 h后，TG、TC与LDL-C水平降低，HDL-C水平升高。而高剂量组3 h后，TG、TC、LDL-C、HDL-C水平与心肌梗死组相比无变化。以上结果表明：一定浓度的瘦素预处理能够改善血脂代谢紊乱，即通过“脂肪-胰岛素”轴——脂肪增加可促使瘦素分泌，一定浓度的瘦素可抑制胰岛素分泌，从而减少脂肪的合成与贮存；而高浓度的瘦素预处理并不会产生相应的调脂作用。

本研究表明，给予一定浓度外源性瘦素来干预糖尿病大鼠MIRI过程，可对受损心肌产生相应作用，且以低中剂量产生的保护作用效果最佳。其机制可能为：(1)低中剂量外源性瘦素预处理通过降低内源性瘦素实际水平而改善机体高瘦素水平状态，并通过瘦素与胰岛素之间双向调控作用来改善IR状态。(2)低中剂量瘦素预处理能够下调TNF-α、MDA水平减轻心肌局部炎症和脂质过氧化反应，并因此减少这些因素所介导的IR状态而带来的损伤。(3)低中剂量瘦素预处理能够通过“脂肪-胰岛素”轴改善糖尿病大鼠血脂代谢紊乱状况。

综上所述，在2型糖尿病大鼠MIRI发生发展的病理过程中，机体存在炎症反应、氧化应激、高瘦素水平、IR及血脂紊乱等状态，而低中剂量瘦素预处理可通过改善这些状态而降低心肌损害作用，这为糖尿病患者MIRI的防治提供了新的方向。

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