江西南昌郊区松树花粉过敏原的分离与鉴定

罗忠勤，陈小文

(南昌大学第一附属医院检验科,江西南昌330006)

·实验研究·

江西南昌郊区松树花粉过敏原的分离与鉴定

罗忠勤，陈小文

(南昌大学第一附属医院检验科,江西南昌330006)

目的对江西南昌郊区松树花粉的变应原组分进行分离及免疫学鉴定。方法提取松树花粉粗提液，然后通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对松树花粉的蛋白质组分进行分离并测定其分子量,采用免疫印迹(Western-blotting)法鉴定其变应原成分。结果松树花粉粗提液有10余条蛋白带,其中分子量为12kD、26kD和100kD的蛋白可与松树花粉过敏性病人血清IgE结合，其中26kD为主要变应原。结论对松树花粉变应原进行了初步的分离、鉴定，为进一步对松树花粉变态反应性疾病的临床诊断和治疗提供初步的实验基础。

松树花粉;变应原;SDS-PAGE；Western-blotting

变态反应性疾病是临床上的常见病、多发病。花粉作为一种重要的吸入性的过敏原,可引起“花粉症”(枯草热)等疾病的发生及相应病症,如眼结膜、鼻黏膜和支气管过敏症状,甚至哮喘发作[1,2]。马尾松在江西地区被广泛地用作经济造林，同时具有种植面积广泛，开花期长的特点，能产生大量花粉,且此类花粉带有气囊,可借风力飘散至极远地区。国内外不少气传致敏花粉调查均证实其为春季主要花粉之一[3-6]。松树花粉大小约为60～120μm，不易进入下呼吸道，并且蛋白含量低。因此长期以来被认为具有低致敏性。近来，有不少文献报道通过对花粉症患者进行皮内试验发现松科花粉亦是其主要过敏原之一[7,8]。但鲜见对其过敏原进行分离和鉴定的报道。因此我们对南昌市郊主要经济林之一—马尾松花粉粗提液进行分离,并同时对其花粉变应原免疫学特性进行鉴定，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料松树花粉采自南昌市郊；14例对松树花粉过敏患者血清标本由南昌大学第一附属医院提供。

1.2 主要仪器和试剂垂直电泳槽、转膜电泳槽、凝胶成像及分析系统。丙烯酰胺(Acr);十二烷基硫酸钠(SDS)；生物素标记的IgE二抗、辣根过氧化物酶标记的亲和素(链霉亲和素)；其余均为国产分析纯试剂。

1.3 松树花粉粗提液的提取取松树花粉适量于液氮中充分研磨，按1∶3的比例用丙酮4℃浸泡，去脂直至上清澄清。挥发去丙酮，干燥后称重，以1∶20比例加入Coca’s液(碳酸氢钠2.75g，氯化钠5g，结晶酚4g。加蒸馏水至1000ml，pH8.2)，搅拌提取72h，12000r/min，离心10min，上清用蒸馏水透析，以上操作均在4℃进行。

1.4 松树花粉粗提液进行SDS-PAGE采用SDSPAGE体系对松树花粉粗提液中蛋白质组分进行分离并比较其分子量。SDS-PAGE体系采用分离胶12%、浓缩胶5%,考马斯亮蓝R-250染色液染色，脱色后用凝胶成像及分析系统拍照。

1.5 松树花粉变应原的免疫学特性鉴定采用Western-blotting方法对松树花粉变应原进行免疫活性分析，操作步骤如下：将凝胶中的蛋白条带转移至硝酸纤维膜上；用TBS洗涤硝酸纤维膜3次；每次5min；将硝酸纤维膜用1%BSA封闭液封闭(4℃过夜)；用TBST洗硝酸纤维膜3次,每次5min；加对花粉过敏患者血清(用1%BSA-TBST进行1;9稀释)，37℃孵育2 h；同上洗膜3次；加入1∶1 000倍稀释的生物素标记的IgE二抗，室温孵育2h；同上洗膜3次；加入1∶1000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的亲和素，室温孵育2h；同上洗膜5次，加入DAB(3,3＇-二氨基联苯胺)显色，凝胶成像及分析系统摄像后分析其相对分子质量。

2 结果

2.1 松树花粉粗提液的SDS-PAGE松树花粉粗提液进行SDS-PAGE，结果显示松树花粉粗提液主要有10余条深浅不一的蛋白区带,其中12kD、26kD区带蛋白含量丰富(图1)。

图1 松树花粉粗提液SDS-PAGE

2.2 松树花粉特异性变应原鉴定花粉过敏患者血清对松树花粉粗浸液中的变应原进行免疫印迹(图2),结果显示,松树花粉提取液中可与过敏性病人血清IgE结合的蛋白质分子量分别为12kD、26kD和100kD，其中分子量为26kD的为主要变应原，可识别11/14份血清。分子量为12kD的变应原，可识别4/14份血清。

3 讨论

松属花粉是我国多数地区重要的春季花粉致敏原[3-6]，然而松树花粉由于其颗粒微粒较大，不易进入下呼吸道，并且蛋白含量低。因此长期以来被认为具有低致敏性。但近来多例报道证实了松树花粉是我国部分城区的致敏原之一[7，8]。国外也有资料报道松属花粉是多数地区重要的春季花粉致敏原。Gioulekas D[9]对希腊15年间的致敏花粉进行记录，发现松树花粉数量占全年8.9%，1311例过敏性哮喘患者对松树花粉致敏率为9.3%。Freeman GL[10]对过敏性患者进行皮内试验，发现对松树花粉阳性致敏率为1.5%。Shida T[11]对日本最近十年花粉调查，发现最近十年尽管花粉数量计数不变，但是对松树花粉皮内试验阳性致敏率由2%上升到5%～6%。Park HJ[12]发现韩国最近20年对松树花粉皮内试验阳性致敏率由2.9%上升到14.3%。松树花粉除了本身的抗原性外，还与其他多种物质存在交叉反应。据报道在对松子食物过敏的患者血清中发现存在对松树花粉提取物特异性的IgE，并且对松子食物过敏的患者易形成松树花粉热。因此松子和松树花粉两者之间存在交叉反应[13,14]。另外松树花粉和抗碳水化合物决定簇(CCDs)之间存在交叉反应[15]。Gastaminza G[16]等在松树花粉提取物皮试阳性患者血清中，发现有85%的患者血清对42kD过敏原出现阳性反应，40%患者对6～8kDa过敏原出现阳性反应，不同的松树种类之间松树花粉的过敏原存在交叉反应。并且许多患者仅仅单对松树花粉致敏，因此对这些患者进行特异性免疫治疗是极有可能的[17]。

图2 松树花粉过敏患者血清的免疫印迹

本实验对南昌市郊区的被广泛地用作经济造林的松科之一—马尾松的花粉过敏原进行分析。采用改进的方法对松树花粉蛋白进行提取[18]，利用SDS-PAGE和Western-blotting的方法对松树花粉提取液进行分离和免疫学鉴定。发现在我区的松科花粉主要过敏原的分子量为26kD，也是粗提液中含量最丰富的蛋白之一。因此，有必要对该过敏原进行纯化，期望得到单一的变应原制剂，实现对我区松科花粉过敏患者进行更安全、更有效的诊断和脱敏治疗。

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Isolation and immunological characterization analysis of allergen in pine pollen

L
UO Zhongqin,CHEN Xiaowen.Department of Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 330006,China.

Objective To isolate and characterize the allergenic components of pine pollen.Methods Pine pollen coarse extraction fluid was extracted,and the proteins of pine pollen extraction and their molecular were analyzed by SDS-PAGE.To characterize the allergenic components,pine pollen coarse extraction fluid was analyzed by western-blotting.Results The pine pollen coarse extraction fluid displayed more than ten protein bands by SDS-PAGE,and three bands(relative molecular weights were 12 kD,26 kD and 100 kD,respectively)could react with IgE in the sera of patients with allergy to pine pollen.Among the three bands,the 26 kD protein was the major allergen.Conclusion Our study of preliminary isolation and immunological characterization of the allergenic components in pine pollen will be used as a base for diagnosis and therapy of pine pollen related allergy.

Pine pollen;Allergen;SDS-PAGE；Western-blotting

R392.8，R446.62

A

1674-1129(2014)06-0688-02DOI∶10.3969/j.issn.1674-1129.2014.06.013

2014-08-21；

2014-10-28)

江西省卫生厅基金(编号：20121039)

罗忠勤，女，出生于1963年8月，学士学位，副主任技师。研究方向为免疫学检验。

陈小文，男，出生于1975年12月，硕士学位，副主任技师。研究方向为免疫学检验。