O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶在子宫颈癌中的表达及临床意义

张志勇，邓荣春，周爱群，施桥发

(1、江西省人民医院检验科，江西南昌330006;2、南昌大学基础医学院免疫学教研室,江西南昌330000)

·论著·

O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶在子宫颈癌中的表达及临床意义

张志勇1，邓荣春1，周爱群1，施桥发2

(1、江西省人民医院检验科，江西南昌330006;2、南昌大学基础医学院免疫学教研室,江西南昌330000)

目的探讨O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)在子宫颈癌组织中表达情况及其临床意义。方法采用免疫组织化学染色方法检测子宫颈癌组织中MGMT的表达。结果60例子宫颈癌组织中MGMT的阳性表达率为93.33%，显著高于14例对照正常宫颈组织中阳性率42.8%,(P＜0.05)；子宫颈癌患者中，Ⅰ期与Ⅱ期的MGMT阳性率分别为100%、95.83%，显著高于Ⅲ-Ⅳ期的阳性率62.5%(P＜0.01)。结论MGMT的表达水平与宫颈组织癌变发展的进程相关，其在宫颈癌组织的高表达可为宫颈癌的诊断提供重要依据。

∶O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶；子宫颈癌；免疫组织化学染色

子宫颈癌在年轻女性中的发病率仅次于乳腺癌排在第二位，世界范围内统计(2000年)每年大约有50万左右的宫颈癌新发病例，25万人死于子宫颈癌，其中80%的病例发生在发展中国家，50%的病例发生在亚洲[1]。中国每年有15万左右新发病例，有大约10万人死于子宫颈癌，因此，宫颈癌是我国女性最常见的肿瘤之一。O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(O6-methylguanine DNA methyltransferase MGMT)是将O6-鸟嘌呤加合物从DNA上移除，对损伤的DNA进行修复的酶。它能特异性的修复DNA序列中的O6烷基鸟嘌呤损伤，维持基因组的精确性和完整性，是人类细胞中至今为止发现的唯一修复该损伤的甲基转移酶[2]。Reese等[3]研究发现，MGMT含量与肿瘤发生相关，正常组织中一定水平的MGMT表达可抑制突变发生和原癌基因活化。本实验通过研究06-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶在子宫颈癌组织中的表达情况，并与其正常宫颈组织中表达情况相比较，探讨其在子宫颈癌发生、发展中的临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料以江西省人民医院肿瘤科与妇产科2011年3月至2012年1月经病理确诊的60例子宫颈鳞癌组织为癌组，年龄32～74岁、平均(54.2± 10.3)岁，按照国际肿瘤协会FIGO 2009修订的国际诊断和分期法，Ⅰ期28例、Ⅱ期24例、Ⅲ～Ⅳ期8例。对照组为14例子宫肌瘤患者行子宫切除术后经病理证实的正常宫颈组织，年龄29～62岁、平均(46.2±7.7)岁。所有患者均无恶性肿瘤史并排除乙肝表面抗原阳性个体，术前均未接受化疗或放疗。

1.2 试剂鼠抗人MGMT抗体购自武汉博士德生物工程公司，S-P-kit试剂盒购自上海长岛生物技术有限公司。

1.3 方法免疫组织化学染色(SP)法：切片脱蜡去水，3%H2O2封闭，一抗4℃反应过夜，二抗室温孵育20 min。二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，脱水，干燥，封片，显微镜下观察。实验中以PBS代替一抗做阴性对照，乳腺癌组织做阳性对照。

1.4 结果判断MGMT蛋白在细胞核或细胞质或细胞膜中出现显色颗粒为阳性。积分判定：显微镜下染色细胞百分率：＜5%为0分，5%～25%为1分，25%～75为2分，＞75%为3分；染色强度：不显色或显色不清晰为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，深棕色为3分。综合积分按照公式计算：综合积分=(染色细胞积分+染色细胞强度积分)/2；综合判定：积分＜0.5为“-”(无表达)，1.0～2.0分为“+”(中等强度表达)，2.0～2.5分为“++”(强表达)，＞2.5分为“+++”(完全表达)。

1.5 统计学方法采用SPSS18.0软件进行统计分析，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

癌组与对照组MGMT蛋白表达阳性率分别为93.33%与42.86%，P＜0.01；MGMT蛋白表达强度在(+)水平为主，见表1和表2。MGMT蛋白表达水平与临床分期有明显相关性，P＜0.01，如表3所示。

表1 MGMT蛋白在子宫颈癌及其对照中的表达情况

表2 MGMT蛋白在子宫颈癌及其对照中的表达

表3 MGMT蛋白表达与肿瘤临床分期的关系

3 讨论

研究表明，烷化剂导致突变形成肿瘤的主要机制主要是能够在DNA分子鸟嘌呤O6位发生烷基化，同时O6鸟嘌呤加合物可与相应的胞嘧啶残基发生交联而封闭DNA复制。MGMT是一种普遍存在的DNA修复酶，可以保护染色体免受烷化剂的致突变作用、致癌作用和细胞毒性作用损伤，它能将O6鸟嘌呤加合物从DNA上移除，从而在突变前中和这种损伤作用[4]，防止肿瘤的形成。如果MGMT结构和数目异常或缺失，不能发挥正常的作用或作用不足，将导致癌基因的激活和抑癌基因的失活，进一步发展形成肿瘤。MGMT结构异常通常表现为MGMT启动子甲基化，目前已在多种癌组织中发现频率相当高的MGMT启动子过甲基化和该基因的不表达[5-7]，MGMT的表达在正常细胞和肿瘤细胞中都有很大的差异，有研究表明MGMT在多种肿瘤中呈高表达，与多种肿瘤的发生发展密切相关，并且在不同的组织细胞内分布也不同，MGMT在细胞浆内合成，在细胞核发挥作用[8]。关于MGMT与肿瘤的关系，有国外学者研究认为：细胞的原癌基因一旦发生突变其产物可能通过一定的途径而激活DNA甲基化酶，从而使DNA上的鸟嘌呤在O6位发生甲基化，导致DNA发生碱基配对的错误(G：C变为G：T)，或O6-甲基鸟嘌呤和对侧键上的胞嘧啶产生交联反应，使复制难以继续，这些异常变化将通过细胞分裂周期中的检验系统激活DNA内切酶导致DNA片段化，进而引起细胞凋亡；而MGMT基因甲基化，其表达的MGMT蛋白会将已甲基化的DNA鸟嘌呤O6位上的甲基转移到自身的半胱氨酸巯基上，从而使癌细胞顺利通过细胞周期监测点，获得无限增殖的能力[9]。

有研究显示，MGMT在肝脏组织中高表达可抑制烷基致癌物质引起的肝肿瘤[10]，提示MGMT表达与某些肿瘤发生呈明显负相关。MGMT在宫颈癌的中的表达情况仅见少量报道，阿比达·阿布都卡德尔等研究表明MGMT在我国维吾尔族妇女宫颈癌中表达阳性率为84%，与对照组比较有统计学意义[11]。在本实验中，通过检测宫颈癌组织与对照组MGMT蛋白的表达情况，发现宫颈癌组织中MGMT蛋白的阳性表达率(93.33%)明显高于对照组(42.8%)，但处于低蛋白表达水平，染色阳性强度以(+)为主；子宫颈癌中MGMT表达增高可能是因为宫颈癌宫颈组织中DNA中存在大量甲基化损伤，例如容易受到电离辐射和有毒试剂的诱导而异常表达，从而导致MGMT蛋白代偿性的升高，以此来修复这些甲基化损伤。

MGMT表达水平和肿瘤的分级及预后有着明显的关系，Matsukura等研究60例肝细胞癌中的MGMT和Hmlh1表达，发现其中7例缺少两种蛋白，其pTNM分级明显高于另25例同时有这两种蛋白表达的病例，并且这7例的预后较差。胃癌MGMT启动子甲基化与淋巴转移、肿瘤分级，以及生存期有明显的相关性[12]。本研究依据国际肿瘤协会FIGO 2009修订的国际诊断和分期法分期后，发现早期癌组织MGMT蛋白阳性表达率比晚期癌组织MGMT蛋白阳性表达率高，这可能是随着病情的进展，MGMT蛋白表达的代偿性下降所致。本研究表明MGMT蛋白的高表达与子宫颈癌形成有着密切关系，并在其不同时期表达量明显不同，因此检测MGMT蛋白表达状况对临床上宫颈癌的诊断、分期、治疗有一定的应用价值。

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Expression and clinical significance of O6-methylguanine DNA methyltransferase in cervical cancer tissues

ZHANG Zhiyong,DENG Rongchun,ZHOU Aiqun,et al.Department of Clinical Laboratory of Jiangxi Provincial People's Hospital,Nanchang 330006,China.

Objective To investigate the expression of O6-methylguanine DNA methyltransferase(MGMT)and its clinical significance in cervical cancer.Methods The expression of MGMT in cervical cancer tissues was detected by immunohistochemistry staining method．Results The expression of MGMT in cervical carcinoma group was higher than that in normal cervical tissues,and the positive rates were 93.33%and 42.8%respectively(P＜0.05).In PhaseⅠandⅡcervical cancer,the expression rates of MGMT (100%and 95.83%respectively)were significantly higher than that in PhaseⅢ-Ⅳcervical cancer(62.5%,P＜0.01).Conclusion MGMT expression level associates with the development process of cervical cancer,its high expression in cervical cancer tissue plays an important role in the diagnosis of cervical cancer.

O6-methylguanine DNA methyltransferase,Cervical cancer;Immunohistochemistry staining

R737.33,R446.8

A

1674-1129(2014)06-0680-03DOI∶10.3969/j.issn.1674-1129.2014.06.010

2014-07-24；

2014-08-29)

江西省卫生厅科技计划项目(No.20092025、20092026)。作者简介：张志勇，男，出生于1979年3月，硕士，主管技师，从事临床免疫学相关研究。

施桥发，男，出生于1972年8月，博士，副教授，主要从事肿瘤免疫学治疗研究。